化學品快速生物降解性六種經典測試方法的技術要點比對

劉純新，沈英娃，黃星，于麗娜，楊力，聶晶磊，周紅

環境保護部化學品登記中心，北京 100012

化學品快速生物降解性是受試物質(有機物)在限定時間內與接種微生物接觸，表現出的生物降解能力［1］，是鑒別化學物質的環境危害性和持久性，進行分類和標簽［2］，評價和控制環境風險［3］的基本指標。若通過標準方法得到的測試結果表明該受試物質在環境中可被迅速地生物降解，列為“易生物降解”類物質［1］。國際上普遍等效采用經濟合作與發展組織(OECD)的六種經典快速生物降解性測試方法［4］。歐盟2008年實施的《關于化學品注冊、評估、許可與限制(REACH)法規》和 EC:440/2008法規［5］將這六種方法作為技術法規(相當于我國的強制性國家標準)的C.4部分，要求進口到歐盟成員國的化學品提交這些測試數據。

我國將于2011年12月實施的《危險化學品安全管理條例》［6］，規定了環境保護主管部門負責組織危險化學品的環境危害性鑒定和環境風險程度評估。作為履行該職責的重要技術內容，快速生物降解性數據的科學性、可靠性更加受到各方面的關注。

在國際貿易和環境管理的共同壓力下，我國開展化學品、新化學物質快速生物降解性測試的需求增加。一些測試機構和人員由于受專業背景和測試經驗的限制，出具的測試數據質量不高。針對審閱測試報告和現場檢查發現的問題，結合制訂化學品測試標準，對這六種快速生物降解性測試方法進行了比對研究，以期引起同行的關注，促進我國化學品快速生物降解性測試整體水平的提升。

1 我國采用快速生物降解性測試方法的現狀

OECD的六種經典快速生物降解性測試方法在其“化學品測試導則”第三部分，具體代號:301A溶解性有機碳(DOC)消減試驗，301B二氧化碳(CO2)產生試驗，301C改進的MITI試驗(Ⅰ)，301D密閉瓶試驗，301E改進的OECD篩選試驗和301F呼吸計量法試驗［7］。

我國2004年實施的HJ/T 153—2004《化學品測試導則》引用了OECD的這六種方法。原國家環境保護總局2003年發布實施、環境保護部2010年修訂實施的《新化學物質環境管理辦法》以及《新化學物質申報登記指南》要求，在我國申報登記的新化學物質必須提交基于這六種方法的快速生物降解性數據［8-10］。

國家質量監督檢驗檢疫總局和國家標準化管理委員會于2008年將OECD的這六種方法等同轉化為六項推薦性國家標準①這六項國家標準與同系列的80項化學品安全測試方法標準一起榮獲2010年度國家質量監督檢驗檢疫總局和國家標準化管理委員會聯合頒發的“中國標準創新貢獻獎”二等獎，編號:2010-84-2-05。，分別為 GB/T 21803—2008《化學品快速生物降解性DOC消減試驗》，GB/T 21856—2008《化學品快速生物降解性 二氧化碳產生試驗》，GB/T 21802—2008《化學品快速生物降解性 改進的 MITI試驗(Ⅰ)》，GB/T 21831—2008《化學品快速生物降解性 密閉瓶法試驗》，GB/T 21857—2008《化學品快速生物降解性 改進的OECD篩選試驗》和GB/T 21801—2008《化學品快速生物降解性呼吸計量法試驗》［11-16］。概述這六種方法技術要點的《化學品快速生物降解性 通則》(國家標準制訂計劃編號:20081305-T-469)的起草工作已經完成，即將發布實施。OECD于2006年在“301B二氧化碳(CO2)產生試驗”基礎上推出的新方法“310密閉瓶二氧化碳(頂空試驗)法”(該方法的特點將另文論述)［17］，尚未轉化為我國標準。

2 經典快速生物降解性測試方法的共同點

2.1 原理

六種測試方法共同的原理是:將含受試物質的無機培養基溶液或懸浮液接種微生物以后，以受試物質作為唯一的有機碳源，在黑暗或散射光條件下好氧培養。通過空白對照組來校正接種微生物內源呼吸引起的誤差。試驗通常持續28 d，以固定時間間隔測定各參數的變化，計算受試物質快速生物降解率，繪制生物降解曲線［1，7］。如果未到 28 d，生物降解曲線已先達到穩定期(曲線上至少連續3次測定值都保持平穩狀態)，可提前結束試驗;如果第28天生物降解曲線還未達到穩定期，應延長試驗期，但測試結果為陰性，即該物質不具有快速生物降解性。

若試驗DOC的去除率達到70%，或生物降解耗氧量達到理論需氧量(ThOD)的60%，或CO2產生量達到理論二氧化碳產生量(ThCO2)的60%，即認為達到快速生物降解的通過水平。28 d內的生物降解率或10 d觀察期(觀察期窗口從DOC、ThOD的去除率達到10%，或CO2產生量達到ThCO2的10%開始;為減少取樣和燒瓶的數量，某些情況可采用14 d觀察期)的降解率達到通過水平，可認為受試物具備快速生物降解性;如果在28 d后達到通過水平，則不具備快速生物降解性。

2.2 受試物質必備信息

試驗前，必須已知或測得受試物質的溶解度、蒸汽壓和吸附性，以此選擇最合適的測試方法;若掌握受試物質對細菌的毒性信息，有助于選擇合適的試驗濃度［18-19］;掌握受試物質的純度或主要成分的相對比例、化學結構式或分子式，用于計算降解參數的理論值或對測定值進行驗證，如理論需氧量(ThOD)、理論二氧化碳產生量(ThCO2)、DOC、總有機碳(TOC)和化學需氧量(COD)。

2.3 參比物質

苯胺(新蒸餾的)、醋酸鈉或苯甲酸鈉可以作為參比物質，可以選其中一種作為程序對照組和毒性對照組進行平行試驗。這三種參比物質在以上六種方法的試驗中，均可大部分降解。

2.4 試驗用水

為減少對接種微生物的抑制，試驗用水必須是高純度去離子水或蒸餾水，不含對微生物有毒害作用的物質(如Cu2+)。對于每組、每系列試驗，必須使用同一批水［1，7］。

3 各測試方法的適用范圍

若某受試物質在水中的溶解濃度不低于100 mg/L，而且在水中不易揮發，不被玻璃瓶壁和連接管吸附，這六種方法都適用。對難溶于水(水中溶解濃度＜100 mg/L)、易揮發和易吸附的化學物質，適用的測試方法見表 1［1，7］。

由表1可見，對一般的難溶于水、易揮發、易吸附的化學物質，可以從301C、301D、301F三種方法中選一種進行試驗。301A和301E兩種方法適用范圍有限，不能用于一般的難溶于水、易吸附、易揮發的化學物質測試。雖然對于一些中等揮發性的化學物質，可在保證試驗容器密閉、預留足夠頂部空間并建立無菌對照組等前提條件下，采用301A和301E方法進行試驗，但由于操作復雜，干擾因素多，不如選擇其他方法。

表1 六種快速生物降解性測試方法的適用范圍Table 1 Applicability of the six test methods

4 六種測試方法的試驗要求

4.1 儀器設備和操作要點

六種方法的儀器設備、操作要求見表2［11-16］。

表2 六種快速生物降解性測試方法的儀器設備和操作要求Table 2 Apparatus and technique essentials of the six test methods

4.2 反應容器組數和瓶數

若按接種受試物質組和空白對照組都是兩個平行操作計算(即各方法對反應容器數量的最低要求)，301A 的反應容器需要 5 ～8 組燒瓶［11］，301B需要5 ～7 組［12］，301E 需要5 ～8 組［15］，301F 需要5～7組。為確保試驗的穩定性和復現性，實際操作中往往采用三個平行。這四種方法都需要增加兩組燒瓶。如果在進行301F試驗時，要測其中的DOC或受試物質濃度，需要額外再增加一組燒瓶作為吸附對照［16］。

301C最初是日本通商產業省(Ministry of International Trade and Industry，MITI)開發的方法，由于具有顯著的優點，被很多國家采用。該方法采用專用的呼吸測定儀，配備六個作為反應容器的300 mL燒瓶，其中三個作為接種受試物質組，一個作為空白對照組［13］。

301D以BOD瓶作為反應容器，最少需要36個瓶。對于大多數受試物質，為了繪制出生物降解曲線的各階段，保證取樣的次數和頻率，試驗至少需要60個BOD瓶。由于接種細菌數較少，為確保試驗的準確性，往往同時進行2個不同濃度(2和5 mg/L，以 ThOD 計)的試驗，至少需要100 個瓶［14］。

4.3 各測試方法對試驗水質的要求

為防止水中雜質、離子交換樹脂及細菌、藻類產生的物質對試驗結果的干擾，301A、301B、301C、301E、301F五種方法試驗前要預先測定試驗用水的DOC濃度，測得的DOC值不得高于受試物質濃度的10%［11-13，15-16］。301D 不需要預先測定水中 DOC濃度，但要求試驗用水的耗氧量低，含接種微生物的空白對照組在28 d的耗氧量不應超過1.5 mg/L(以DO 計)［14］。

4.4 難溶受試物質的前處理要求

對于水中溶解濃度低于100 mg/L的受試物質，如果能保證其均勻分散在水中，可從301B、301C、301D、301F四種方法中選擇一種。但是，采用攪拌、超聲等方式使受試物質分散時，剪切力不能過強，要防止過熱、泡沫過多。

301C不允許使用助溶劑或乳化劑進行前處理［13］。301B、301D、301F 三種方法，如果使用助溶劑促進受試物質溶解，或使用乳化劑使受試物質呈穩定的分散狀態，就必須設助溶劑/乳化劑對照組，而且要求助溶劑、乳化劑在試驗條件下不降解、不起泡，對接種微生物無毒害、無抑制作用［12，14，16］。

4.5 受試物質和參比物質的添加要求

根據受試物質和參比物質在水中溶解度的不同，采用不同的方法添加至試驗容器中。對于水中溶解濃度高于1 g/L的物質，可事先配備合適濃度的儲備液，試驗時，再稀釋成最終受試溶液，加入試驗容器。

對于水中溶解濃度低于1 g/L的物質，在選擇301B、301C、301D、301F 中的任一方法時，為避免稀釋培養基緩沖液，不能采用配儲備溶液的方式，只能直接溶于培養基或直接添加、分散到培養基中［12-14，16］。

301D特別要求用虹吸方法［14］向BOD瓶內加試驗培養基、受試物質和參比物質，充滿瓶。靠攪拌混合均勻，輕拍瓶壁排除氣泡。

4.6 取樣要求

對于水中溶解濃度低的物質，為了避免取樣的誤差，在取樣前，要保證受試物質分散均勻。

301A和301E兩種方法錐形瓶中的水分會隨試驗時間的延長而蒸發，要求取樣前向錐形瓶中補充相應量的水并充分混合，而且要求將容器壁上附著物質再次溶解或懸浮。若采用2 L錐形瓶作反應容器，每個瓶的內容物定容至1 L，每2 d取樣一次，每組一個瓶即可滿足28 d的試驗要求。缺點是，取樣前補充水分的操作復雜且不易精確控制;隨著試驗時間的延長、取樣次數的增加，燒瓶內容物體積變化較大。若301A、301E方法采用250 mL錐形瓶，每個瓶的內容物定容至100 mL，那么每個瓶只能取一次樣，需要250 mL錐形瓶的個數將與取樣次數相同。

301B采用2～5 L的試驗燒瓶作反應容器，使用Ba(OH)2作吸收劑時，每組至少需要10個吸收瓶，28 d的試驗至少需要70個吸收瓶。若為降低成本、節省空間，采用半透明的塑料瓶代替玻璃瓶作吸收瓶，將不利于觀察瓶內沉淀。若使用NaOH代替Ba(OH)2作吸收劑，將減少CO2吸收瓶個數。吸收瓶適合用膠塞;若用磨口玻璃瓶和玻璃塞，通過堿與玻璃反應可達到密封效果，但損失的堿液會引起滴定的偏差。

301C采用專用的呼吸測定儀，每個燒瓶均配有特制的CO2吸收瓶，用堿石灰作吸收劑［13］，結構緊湊;能自動連續記錄耗氧量，不需取樣，操作簡單。但價格較高，國內只有少數測試機構具備。

301D要求每次每組至少取兩瓶，測定DO和pH后，將瓶棄去。如果按14 d觀察期試驗，至少每周取樣一次;如果要確定10 d觀察期，至少每周取樣2次，或每2 d取樣一次。這樣，至少需要60個BOD瓶，操作較繁瑣，勞動強度較大。

301F采用自動呼吸測定儀，自動連續記錄耗氧量，不需取樣，操作簡單。

4.7 含氮受試物質的要求

如果選擇301C、301D或301F測含氮物質的快速生物降解性，由于氮的硝化作用會消耗一部分溶解氧，使測定結果產生偏差。為消除這種干擾，應根據試驗結束時NO3-和NO2-的濃度進行校正［13-14，16］。

關于六種方法的受試物質、接種微生物的選擇、培養基成分、溫度等操作要求和注意事項，將另文討論。

5 常見問題及處理措施

5.1 缺少受試物質信息，測試方法選擇不當

由于缺少溶解度、蒸汽壓和吸附性方面的數據，或數據不準確，使選擇的測試方法不適合該受試物質，導致試驗結果不可靠。要解決、避免類似的問題，測試機構不但要具備熟悉各種快速生物降解性測試方法的技術人員，而且還要具備熟悉化學品常規理化性質測試的人員和進行驗證理化參數的技術能力，對必要的參數能夠進行驗證試驗或補測。

5.2 試驗方案缺乏針對性，取樣頻次不夠

對于301B、301D等非自動取樣的試驗，方法要求如果按14 d觀察期試驗，至少每周取樣一次［12，14］。若不考慮受試物質的性質，試驗方案一律按每周取樣一次設計，由于數據少，某些受試物質生物降解曲線的變化趨勢可能不明顯。應對措施是，分析受試物質的結構信息，適當增加取樣頻次。

5.3 缺少水質數據，異常結果解釋不清

試驗用水的水質數據往往被忽視，對一些異常的試驗結果，無法判斷是由于水中雜質干擾還是由于試驗操作不當所致。解決的措施是，定期對試驗用水進行全分析，去除抑制微生物活性的物質;在試驗前，檢測試驗用水溶解氧的消耗量或水中DOC濃度。

5.4 分散不均勻，試驗結果不可靠

一些難溶的受試物質，在28 d的試驗期間，分散體系失穩，或沉淀到瓶底，或上浮到液面，使試驗結果不可靠。應對措施:應細心觀察，及時發現異常并采取措施;對于不能恢復的，應在減少受試物質添加量的情況下，重新進行試驗。

6 結論和建議

(1)化學品種類繁多，性質各異，每測一個物質的快速生物降解性，都相當于一項研究課題，絕不同于一般的檢測工作。要準確、有效地測試化學品快速生物降解性，測試機構應具備物理化學、分析化學、環境微生物等方面的專業人員，并對六種經典方法深入研究、融會貫通。

(2)六種經典方法的適用范圍不同，應根據受試物質的性質選擇適當的測試方法。301A和301E只適用于易溶于水、不易揮發、不易吸附的物質;301B不適用于易揮發的物質。采用301C、301D、301F三種方法測含氮受試物質時，需要校正硝化作用的氧消耗。

(3)六種經典方法對設備和操作的要求各有不同，應根據受試物質的特性和測試機構儀器、設備、場地等條件，設計出有針對性的試驗方案，采用合適的反應裝置，減少、避免對試驗結果的干擾。

(4)試驗人員應嚴格按照各種方法的要求，認真操作，細心觀察。對試驗水質、分散體系的變化要及時發現并排除干擾。

［1］國家環境保護總局.化學品測試方法［M］.北京:中國環境科學出版社，2004.

［2］United Nations.Globally harmonized system of classification and labelling of chemicals(GHS)［M］.3rd ed.New York:United Nations Publication，2009:215-240.

［3］van LEEUWEN C J，VERMERIRE T G.Risk assessment of chemicals an introduction［M］.2nd ed.Dordrecht:Springer，2007:73-409.

［4］Orgnisation for Economic Co-operation and Development.OECD guideline for testing of chemicals［M］.Paris:OECD Publications，1993.

［5］The Commission of The European Communities.Council Regulation(EC)No 440/2008［EB/OL］.［2008-05-30］.http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2008:142:0001:0739:en:pdf.

［6］中華人民共和國國務院.危險化學品安全管理條例［EB/OL］.［2011-03-11］.http://www.gov.cn/flfg/2011-03/11/content_1822902.htm.

［7］OECD.Test No.301:Ready Biodegradability［EB/OL］.［1992-07-17］.http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-301-ready-biodegradability _ 9789264070349-en;jsessionid =1816fjr8gttv3.delta.

［8］國家環境保護總局.HJ/T 153—2004 化學品測試導則［S］.北京:中國環境科學出版社，2004:6.

［9］中華人民共和國環境保護部.新化學物質申報登記指南［EB/OL］.［2010-09-16］.http://www.mep.gov.cn/pv_obj_cache/pv_obj_id_A307C2706731EC4386428C731D210489261E0900/filename/W020100921500388885939.pdf.

［10］周紅，菅小東，聶晶磊，等.新化學物質環境管理技術規范體系的構建［J］.環境科學研究，2010，23(3):272-276.

［11］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 21803—2008化學品快速生物降解性 DOC消減試驗［S］.北京:中國標準出版社，2008.

［12］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 21856—2008化學品快速生物降解性 二氧化碳產生試驗［S］.北京:中國標準出版社，2008.

［13］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 21802—2008化學品快速生物降解性改進的MITI試驗(Ⅰ)［S］.北京:中國標準出版社，2008.

［14］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 21831—2008化學品快速生物降解性密閉瓶法試驗［S］.北京:中國標準出版社，2008.

［15］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 21857—2008化學品快速生物降解性改進的OECD篩選試驗［S］.北京:中國標準出版社，2008.

［16］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 21801—2008化學品快速生物降解性呼吸計量法試驗［S］.北京:中國標準出版社，2008.

［17］OECD.Test No.310:Ready Biodegradability-CO2in Sealed Vessels(Headspace Test)［EB/OL］//OECD.OECD guideline for testing of chemicals.［2006-03-23］. http://titania.sourceoecd.org/vl=8728439/cl=14/nw =1/rpsv/cgi-bin/fulltextew. pl? prpsv =/ij/oecdjournals/1607310x/v1n3/s13/p1.idx

［18］OECD.Test No.209:Activated sludge，respiration inhibition test:OECD guideline for testing of chemicals［EB/OL］.［2010-07-23］.http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-209-activated-sludge-respiration-inhibition-test_9789264070080-en.

［19］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 21796—2008化學品活性污泥呼吸抑制試驗［S］.北京:中國標準出版社，2008.?