百事樂膠囊對慢性應激抑郁模型小鼠血清IL-1β和TNF-α的影響

郭 純，蔡光先*，劉柏炎，易 健，藺曉源

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院省部共建中醫內科學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410007）

百事樂膠囊對慢性應激抑郁模型小鼠血清IL-1β和TNF-α的影響

郭 純，蔡光先*，劉柏炎，易 健，藺曉源

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院省部共建中醫內科學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410007）

目的 探討百事樂膠囊對慢性應激抑郁小鼠行為學及血清白細胞介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量的影響。方法 60只雄性昆明種小鼠隨機分為正常組、模型組、百事樂膠囊高、中、低劑量組和氟西汀組。除正常組外，其他組給予21 d慢性不可預見性應激造模。每天造模前各組小鼠分別予以相應藥物灌胃治療，模型組以等量蒸餾水灌胃。測定小鼠體質量，通過敞箱實驗和懸尾不動實驗檢測小鼠行為學變化，酶聯免疫吸附法（ELISA）測定小鼠血清IL-1β和TNF-α的含量。結果 模型組小鼠發生明顯的行為學改變，水平和垂直活動明顯減少，懸尾不動時間明顯延長；百事樂膠囊高、中、低劑量組能顯著增加小鼠體質量（P<0.05），改善小鼠的行為學指標（P<0.01），百事樂膠囊高、中劑量能降低血清IL-1β和TNF-α水平，與模型組比差異有統計學意義（P<0.05）；與氟西汀組相比，百事樂膠囊高、中、低劑量組各指標差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 百事樂膠囊能顯著改善慢性應激抑郁小鼠的行為學變化，其作用可能與下調慢性應激所致的血清IL-1β和TNF-α水平有關。

百事樂膠囊；慢性應激抑郁模型；小鼠；白細胞介素1β；腫瘤壞死因子α

隨著社會競爭的加劇，諸多應激因素的增加，抑郁癥的發病率呈上升趨勢[1]。應激和心理應激能激活免疫系統，導致細胞因子的產生。細胞因子是一類能在細胞間傳遞信息、具有免疫調節和效應功能的蛋白質或小分子多肽。外周與中樞自身產生的細胞因子影響著中樞神經系統功能，包括神經遞質代謝、神經內分泌功能、神經可塑性等，可導致抑郁性行為[2]。百事樂膠囊具有明顯的抗抑郁作用，李東雅[3]臨床研究顯示，其在改善臨床癥狀和HAMD量表積分方面效果優于氟西汀，為了進一步研究其作用機制，本研究旨在探討中藥復方百事樂膠囊對慢性心理應激抑郁小鼠的行為學及血清細胞因子白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 昆明種雄性小鼠60只，體質量18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2009-0004。實驗過程中動物可以自由攝食和飲水（禁食和禁水應激除外），室溫20～25℃，相對濕度60%～70%。

1.1.2 藥物 百事樂膠囊（專利號CN101816766A）：由湖南省中醫藥研究院制備，由姜黃、人參等組成，批號 ：20110322，0.38 g/粒 ，9 粒/d， 相當于生藥15 g/d。鹽酸氟西汀膠囊，由常州華生制藥有限公司生產，批號：80710001，20mg/粒，20mg/d。

1.1.3 試劑 小鼠IL-1β酶聯免疫吸附 (ELISA)試劑盒和小鼠TNF-α ELISA試劑盒購自美國RD公司（批號：201105）；水合氯醛，天津市科密歐化學試劑有限公司生產，用生理鹽水配制成10%濃度。

1.1.4 儀器 MK3酶標儀（芬蘭Labsystems）；YLS-9A生理藥理電刺激儀（山東省醫學科學院設備站）；SB5200超聲波清洗儀（上海必能信超聲公司）；HH.W21.Cu 600恒溫水浴箱（上海醫療器械七廠）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模 （1）昆明種小鼠60只，適應性喂養一周后，隨機分為6組：空白組、模型組、氟西汀組、百事樂低、中、高劑量組，每組10只。（2）正常組正常飲水攝食，不給任何刺激。其余各組接受為期21 d的不可預知的應激刺激，刺激方法根據文獻[4]改進，包括：12 h禁食，12 h禁水，通宵照明，夾尾（1min），4 ℃冷水游泳 5min，超聲刺激（110 dB，1 h），足底電擊 5min(1 mA，30 V，每隔1min刺激1次，每次持續30 s，共5次)。每天隨機給予一種刺激，使小鼠不能預料刺激的發生，以避免產生適應。

1.2.2 給藥方法 灌胃藥量按60 kg成人體表面積換算成30 g小鼠用量。造模前1 h，模型組小鼠灌胃蒸餾水，氟西汀組小鼠灌胃鹽酸氟西汀藥液2.6mg/（kg·d），百事樂膠囊低、中、高劑量組小鼠灌胃百事樂膠囊藥液 （按生藥量分別為0.95、1.90、3.80 g/（kg·d）。 灌胃量為 0.2 mL/10 g體質量，每天灌胃給藥后給予1種刺激，持續21 d。

1.2.3 體質量測定 所有小鼠于實驗第1、7、14、21天用電子動物秤稱體質量并記錄測定結果。體質量增加（g）=實驗后測定體質量（g）－實驗前體質量（g）。

1.2.4 行為學測定 所有小鼠于造模第21天進行行為學觀察。（1）敞箱試驗：用不透明材料自制敞箱裝置，底面為50 cm×50 cm的正方形，被白線等分為25個等邊方格(10 cm×10 cm)，周邊高30 cm。8:00～12:00之間在安靜的房間內進行觀察。將小鼠置于中心方格內，適應1min后，觀察小鼠5min內的水平活動次數（指穿越格數，四爪均進入的方格方可記數）和垂直活動次數（指前肢直立次數，兩前爪騰空或攀附墻壁）。（2）懸尾實驗：將小鼠尾端2 cm的部位固定，使其呈倒掛狀態，其頭部離地面5～6 cm，用木板隔開相鄰動物的視線，適應1min后，記錄每只小鼠5min內的累計不動時間。

1.2.5 血清IL-1β和TNF-α含量檢測 各組小鼠以10%水合氯醛（4.0 mL/kg）麻醉后，打開胸腔，直接從心臟內抽血靜置后，3000 r/min離心，小心吸取血清，于-30℃保存。小鼠血清IL-1β和TNF-α的含量采用ELISA法檢測，步驟嚴格按照試劑盒的操作說明進行。各個步驟完成后，用酶標儀于450 nm波長處測定OD值。根據標準品（由試劑盒提供）的測定數值，繪制標準曲線，計算樣品中IL-1β和TNF-α含量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 百事樂膠囊對慢性應激小鼠體質量變化的影響

各組小鼠體質量在造模后第7、14、21天均有增加。模型組小鼠體質量增加顯著低于正常組 （P<0.01）；百事樂低、中、高劑量組和氟西汀組小鼠的體質量增加均高于模型組（P<0.05），但仍低于正常組（P<0.05或P<0.01）。百事樂低、中、高劑量組和氟西汀組相比，無統計學意義。見表1。

表1 各組小鼠體質量變化的比較 （，n=10）

表1 各組小鼠體質量變化的比較 （，n=10）

注：與正常組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較 #P＜0.05。

組 別正常組模型組氟西汀組百事樂低劑量組百事樂中劑量組百事樂高劑量組藥物劑量（g/kg）— —0.00260.951.903.807 d 4.90±0.412.46±0.32**3.27±0.67*#3.01±0.71*#3.07±0.56*#3.12±0.64*#14 d 8.36±0.613.59±0.52**5.39±0.79**#5.23±0.63**#5.19±0.69**#5.33±0.80**#21 d 10.44±0.704.50±0.53**6.86±1.01**#6.76±0.79**#6.74±0.58**#6.81±0.92**#體質量增加（g）

2.2 百事樂膠囊對慢性應激小鼠行為學的影響

造模21 d后，模型組小鼠的水平活動次數和垂直活動次數均低于正常組，具有統計學意義（P<0.05或P<0.01），模型組的懸尾不動時間與正常組比較顯著延長，差異有統計學意義（P<0.01）。各治療組小鼠的水平活動次數、垂直活動次數和懸尾不動時間相比均有明顯改善，與模型組相比差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），與正常組比較差異無統計學意義。百事樂低、中、高劑量組與氟西汀組相比無統計學意義。見表2。

2.3 百事樂膠囊對慢性應激小鼠血清IL-1β和TNF-α含量的影響

模型組小鼠血清IL-1β和TNF-α水平均高于正常組，差異具有統計學意義（P<0.05）。百事樂中、高劑量組和氟西汀組小鼠血清的IL-1β水平均低于模型組（P<0.01），與正常組相比差異無統計學意義。百事樂低、中、高劑量組和氟西汀組小鼠血清的TNF-α水平也顯著低于模型組（P<0.05或P<0.01），與正常組比較差異無統計學意義。百事樂低、中、高劑量組小鼠血清IL-1β和TNF-α水平與氟西汀組比較差異無統計學意義。見表3。

表2 各組小鼠水平和垂直活動次數及懸尾不動時間的比較 （，n=10）

表2 各組小鼠水平和垂直活動次數及懸尾不動時間的比較 （，n=10）

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01。

組 別正常組模型組氟西汀組百事樂低劑量組百事樂中劑量組百事樂高劑量組水平活動次數143.43±6.0483.10±6.53**137.12±6.98##114.21±6.10##126.14±7.37##131.50±7.21##垂直活動次數48.15±4.2734.14±3.28*46.15±3.65#42.72±3.95#44.57±3.64#45.85±4.01#懸尾不動（s）62.00±6.20103.00±9.85**66.29±7.54##73.03±9.01##69.23±8.17##68.91±8.39##

表3 各組小鼠血清IL-1β和TNF-α含量的比較 （，n=10，ng/L）

表3 各組小鼠血清IL-1β和TNF-α含量的比較 （，n=10，ng/L）

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01。

組 別正常組模型組氟西汀組百事樂低劑量組百事樂中劑量組百事樂高劑量組IL-1β 9.12±0.3210.75±0.51*8.50±0.39##9.94±0.419.03±0.26##8.81±0.47##TNF-α 27.26±1.9733.24±1.96*25.96±1.23#26.72±2.16#25.69±2.93#24.51±1.37##藥物劑量（g/kg）— —0.00260.951.903.80

3 討論

抑郁癥屬中醫學“郁證”范疇，病始在肝，及于心神。因情而郁，氣血失調是其病機關鍵。郁證之初以氣滯為主，繼發血瘀，瘀結于內，不得宣泄，上犯清竅，則神明失用。情志不暢，氣郁日久，氣血交阻，血流不暢，瘀血停積，則心神不寧。百事樂膠囊是本課題組研發的抗抑郁中藥復方新制劑，由姜黃、人參等組成，具有理氣活血，寧心安神的作用。其組方中姜黃活血化瘀、行氣止痛，善破肝脾二經之血瘀氣結；人參大補元氣、安神益智。

慢性心理應激抑郁模型是基于抑郁癥的環境誘因以及快感缺失的核心癥狀而模擬。各項檢測指標中，體質量反映動物健康狀況，敝箱實驗反映動物在新環境中的探究行為和緊張狀況，懸尾實驗反映動物的絕望情緒及抑郁狀態。本實驗結果顯示，應激后小鼠體質量增長、敝箱試驗活動水平以及懸尾不動時間均出現異常，說明本實驗慢性心理應激動物模型制作成功。百事樂膠囊高、中、低劑量均能有效改善慢性應激對小鼠體質量的影響，提高抑郁模型小鼠的自主活動和探究能力，減少抑郁模型小鼠懸尾不動時間，說明百事樂膠囊能有效改善抑郁模型小鼠的體質量和行為學變化。

抑郁癥的發生常伴一定程度的炎癥反應激活，促炎性細胞因子升高已成為抑郁癥的標志性現象。臨床上觀察到很多應用細胞因子免疫治療的患者表現出一系列抑郁樣癥狀，并且抗抑郁藥能夠阻斷這些癥狀[5]。IL-1β和TNF-α屬于前炎癥細胞因子，是一系列炎癥反應中最早產生的細胞因子。研究表明，心理性應激反應能使腦內情感調節區的IL-1β和TNF-α等促炎癥性細胞因子濃度增加[6]。臨床研究顯示抑郁癥患者治療前血清IL-1β和TNF-α顯著高于對照組，經藥物治療后顯著下降[7-8]。動物實驗研究表明抑郁模型大鼠血清IL-1β和TNF-α含量顯著升高，而藥物可使其水平下調[9-10]。本研究中百事樂膠囊中、高劑量組小鼠血清IL-1β和TNF-α水平均顯著低于模型組，說明百事樂膠囊具有下調抑郁模型小鼠血清IL-1β和TNF-α的作用。

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Effects of Baishile Capsule on serum IL-1β and TNF-α in mice with chronic stress model of depression

GUO Chun,CAI Guang-xian*,LIU Bai-yan,YI Jian,LIN Xiao-yuan
（First Affiliated Hospital,TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410007,China）

Baishile Capsule;chronic stress of depression;mouse;IL-1β;TNF-α

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.11.006.024.03

〔Absrract〕Objective To investgate the effects of Baishile Capsules(BSL)on the behaviors and blood serum IL-1β and TNF-α in mice with chronic stress model of depression.Methods 60 male mice were randomlydivided intohealthycontrolgroup (HCG),modelgroup(MOG),BSL high dose group(HDG),medium dose group(MDG),low dose group(LDG)and fluoxetine group(FTG).Except HCG,others were exposed to chronic stress with 21 days for model.All the animals in treated group were respectively given corresponding medicine before modeling.MOG were given the same volume of distilled water.Body weights of mice were measured,behavioral changes were tested by Open-field experimentand the immobility time in tailsuspension experiment.The contents of IL-1β and TNF-α of mice were tested by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results Obvious behavioral changes were found in MOG，including the reduce of horizontal and vertical activities and the prolong of tail suspension immobility time.Compared with MOG,the body weights of mice were significantly increased （P<0.05） and the behavioral parameters were improved remakably（P<0.01） in HDG,MDG and LDG.The mice serum levels of IL-1β and TNF-α in HDG and MDG were obviously decreased （P<0.05）.Compared with FTG,these indicators of HDG,MDG and LDG had no significant differences（P＞0.05）.Conclution Baishile Capsule can significantly improve the behavior changes of chronic stress mice.Its effect may be related to the downward levels of serum IL-1β and TNF-α.

2012－06－20

國家自然科學基金項目（81202693）；湖南省教育廳科學研究項目（12C0276）；湖南中醫藥大學校級青年基金項目（2011）。

郭 純（1979-），女，湖南醴陵人，講師，博士研究生，主要從事抑郁癥的中醫藥防治研究。

* 蔡光先，男，教授，博士研究生導師，E-mail：lby1203@sina.com。

（本文編輯 彭芝配）