硒化殼寡糖的合成及抗氧化作用研究

金黎明，郝 苗，趙小菁，李春斌，齊小輝，范圣第

(1.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116605;

2.大連市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，遼寧大連 116021)

硒化殼寡糖的合成及抗氧化作用研究

金黎明1，郝 苗2，趙小菁1，李春斌1，齊小輝1，范圣第1

(1.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116605;

2.大連市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，遼寧大連 116021)

以亞硒酸鈉和殼寡糖為原料，合成了硒化殼寡糖，產(chǎn)率為37.26%，硒含量為9.02 mg·g－1。利用紫外－可見光譜、紅外光譜兩種表征手段，證實了硒化殼寡糖的合成。采用鄰二氮菲－Fe2+氧化法、鄰苯三酚自氧化法以及總抗氧化能力試劑盒測定硒化殼寡糖的抗氧化能力。結(jié)果表明，在實驗設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，硒化殼寡糖的抗氧化能力隨著濃度的增加而增加，且硒化殼寡糖的抗氧化能力高于殼寡糖。1 mg·mL－1的硒化殼寡糖對羥自由基的清除率為40.27%，對超氧陰離子的清除率為38.68%，總抗氧化能力為每mL 0.617單位。實驗為研究低毒性、有效的有機補硒產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

殼寡糖;硒化殼寡糖;合成;表征;抗氧化性

殼聚糖(chitosan)是甲殼素(chitin)的N－脫 乙?；漠a(chǎn)物，目前已有研究證明，殼聚糖在化學(xué)水平、細胞水平和動物整體水平上具有一定的抗氧化作用［1－2］。殼寡糖(chitooligosaccharide)是殼聚糖的降解產(chǎn)物，相對于殼聚糖而言，殼寡糖具有相對分子量小，可溶性高，生物活性高等優(yōu)點。近年來的研究證實，殼寡糖在提高人體免疫力，抗癌，降低血壓、血脂、血糖，促進鈣以及其他微量元素吸收等方面有顯著的功效。

硒(selenium)是人體所必需的微量元素之一，人體(按體重70 kg)含硒量為43 mg，正常人體應(yīng)維持硒量14～21 mg，人體日排硒量為0.15 mg，若不進行補硒，則人易患疾病。1997年國際上推薦每人每日需要硒量為0.06 mg。由于硒本身具有極高的抗氧化能力，在延緩衰老、抗癌、增強人體免疫力等方面具有明顯的功效，甚至被人贊譽為“抗癌之王”［3］。但大多數(shù)無機硒化合物毒性較大，最低致死量相對較小(如亞硒酸鈉對大鼠腹腔注射的最低致死量是 3.25～3.5mg·kg－1)，其應(yīng)用受到極大的限制［4］。所以，尋找生物活性相對較高且毒性相對較低的有機硒替代品就成為給機體補硒的首要任務(wù)。目前已有研究表明，有機硒多糖作為補硒劑不僅穩(wěn)定性好，溶出性高，而且釋放出硒后配體多糖不會對機體產(chǎn)生毒副作用，是理想的補硒產(chǎn)品［5－9］，因此對硒化殼聚糖的研究也引起了廣泛的關(guān)注［10－12］。但是，對硒化殼寡糖(chitooligosaccharide－selenium)的研究還相對較少。

本文以亞硒酸鈉和殼寡糖為原料，合成了硒化殼寡糖，利用紫外－可見光譜、紅外光譜兩種表征手段對其進行表征，并采用鄰二氮菲－Fe2+氧化法、鄰苯三酚自氧化法以及總抗氧化能力試劑盒測定其抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

Lambda25型紫外－可見分光光度計(美國PE公司)，370DTGS型紅外光譜儀(美國Thermo公司)，UV－2100型分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)。殼寡糖由中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院提供，分子量為3 000 Da左右。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。總抗氧化能力試劑盒購于上海天呈科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 硒化殼寡糖的合成

硒化殼寡糖參考徐春蘭等［10］介紹的方法進行制備。準確稱取殼寡糖1.0 g，溶于49 mL的去離子水中，加入1 mL冰乙酸，攪拌溶解至澄清。取亞硒酸鈉1.33 g，溶于10 mL的水中，緩慢加入到殼寡糖溶液中。攪拌混勻后放置2 h，使其充分反應(yīng)。加入3倍體積的無水乙醇，室溫條件下過夜醇析。抽濾，并用無水乙醇洗滌2次，冷凍干燥即得硒化殼寡糖樣品。

1.2.2 硒化殼寡糖中硒含量的測定

用鄰苯二胺比色法測定硒含量［13］。

1.2.3 紫外光譜法對硒化殼寡糖進行表征

將殼寡糖和硒化殼寡糖用去離子水配成0.04 mg·mL－1的溶液，去離子水為參比進行紫外光譜測定，波長掃描范圍為200～400 nm。

1.2.4 紅外光譜法對硒化殼寡糖進行表征

將少量的殼寡糖和硒化殼寡糖用KBr壓片，進行紅外光譜測定，測定范圍為400～4000 cm－1。

1.2.5 清除羥自由基的測定

采用鄰二氮菲－Fe2+氧化法測定硒化殼寡糖清除羥自由基的能力，并以維生素C為對照實驗［14］。

1.2.6 清除超氧陰離子的測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定硒化殼寡糖清除超氧陰離子的能力，并以維生素C為對照實驗［15］。

1.2.7 總抗氧化能力的測定

分別取0.100 g的殼寡糖和硒化殼寡糖，加水定容到100 mL，配制成1 mg·mL－1的樣品溶液，按照總抗氧化能力試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 硒化殼寡糖的合成

得到的硒化殼寡糖為無定形的黃色粉末，無臭，產(chǎn)率為37.26%。經(jīng)鄰苯二胺比色法測定硒含量為 9.02 mg·g－1。

2.2 紫外圖譜

紫外－可見吸收光譜圖如圖1。

圖1 紫外－可見吸收光譜圖(a.硒化殼寡糖;b.殼寡糖)

從圖1中可以看出，硒化殼寡糖與殼寡糖的吸收曲線在200～250 nm吸收值下降較快，而在250 nm之后吸收值下降緩慢。在300 nm左右，硒化殼寡糖與殼寡糖相對出現(xiàn)一個明顯的吸收峰。這種差異表明金屬元素硒和殼寡糖之間發(fā)生了反應(yīng)，使硒化殼寡糖的紫外吸收值發(fā)生了變化。

2.3 紅外圖譜

紅外吸收光譜圖如圖2。

圖2 紅外吸收光譜圖(a.硒化殼寡糖;b.殼寡糖)

從殼寡糖與硒化殼寡糖的紅外光譜圖的對比中可以看出，亞硒酸根主要連接在C2位的氨基和C6的羥基上。由以下光譜圖形和光譜數(shù)據(jù)變化得到證明:硒化后殼寡糖的氨基(－NH2)的剪式振動吸收峰由 1 627.92 cm－1移動到 1 629.85 cm－1;殼寡糖分子中的羥基(－OH)的變角振動吸收峰由 1 033.85 cm－1移動到 1 035.77 cm－1;此外，在硒化殼寡糖的紅外光譜中觀測到位于806.25 cm－1的Se=O雙鍵振動峰。據(jù)此推斷，合成的硒化殼寡糖可能在C2位的氨基和C6的羥基上引入了亞硒酸根。

2.4 硒化殼寡糖對羥自由基的清除作用

殼寡糖、硒化殼寡糖和維生素C對OH·的清除率曲線如圖3。

圖3 殼寡糖、硒化殼寡糖和維生素C對OH·的清除率曲線

由圖3可見，殼寡糖和硒化殼寡糖都具有一定的抗氧化能力，且抗氧化能力都隨著質(zhì)量濃度的升高而增強;相同質(zhì)量濃度的硒化殼寡糖抗氧化能力要高于殼寡糖，且隨質(zhì)量濃度升高，這種趨勢愈明顯。以1 mg·mL－1的硒化殼寡糖和殼寡糖為例，它們對羥自由基的清除率分別為40.27%和29.94%，接近于濃度為 0.5 mg·mL－1的維生素C對羥自由基的清除率。

2.5 硒化殼寡糖對超氧陰離子的清除作用

殼寡糖、硒化殼寡糖和維生素C對超氧陰離子的清除率曲線如圖4。

圖4 殼寡糖、硒化殼寡糖和維生素C對超氧陰離子的清除率曲線

由圖4可見，硒化殼寡糖相對于殼寡糖而言，對超氧陰離子具有更好的清除能力。以1.0 mg·mL－1的硒化殼寡糖和殼寡糖為例，其對超氧陰離子的的清除率分別為38.68%和32.18%，高于0.5 mg·mL－1的維生素C對超氧陰離子的清除率。

2.6 硒化殼寡糖的總抗氧化能力

通過計算可得，硒化殼寡糖的總抗氧化能力為每mL 0.617單位，高于殼寡糖的總抗氧化能力(每 mL 0.247 單位)。

3 結(jié)論

本實驗以亞硒酸鈉和殼寡糖為原料，合成了一種新型的有機硒產(chǎn)品——硒化殼寡糖。通過鄰二氮菲－Fe2+氧化法、鄰苯三酚自氧化法以及總抗氧化能力試劑盒測定其抗氧化能力，結(jié)果表明，在實驗設(shè)置的范圍內(nèi)，硒化殼寡糖的抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，由于分子中引入了硒這種具有抗氧化能力的元素，其抗氧化能力要高于單一的殼寡糖，并且隨質(zhì)量濃度升高，這種趨勢愈加明顯。維生素C是已被公認的具有較強抗氧化性的物質(zhì)，常被用作評價抗氧化能力的對照物。本實驗合成的硒化殼寡糖雖然抗氧化性略低于維生素C，但綜合考慮其抗氧化及補硒作用，仍不失為一種較為理想的產(chǎn)品。結(jié)果表明，合成的硒化殼寡糖是一種具有較好抗氧化能力的有機硒多糖，為進一步研究低毒性、高活性的有機補硒劑提供了思路與參考。

［1］金黎明，楊艷，劉萬順，等.殼寡糖及其衍生物對 CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護作用［J］.山東大學(xué)學(xué)報:理學(xué)版，2007，42(7):1 －4.

［2］金黎明，鄭奕，楊艷，等.殼聚糖及其衍生物的抗氧化作用研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(11):66－68.

［3］ZEENG H W，COMBS J G F.Selenium as an anticancer nutrient:Roles in cell proliferation and tumor cell invasion［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2008，19(1):1－7.

［4］孔濤，曲韻笙，朱連勤，等.殼聚糖硒的合成及其理化性質(zhì)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(1):21.

［5］尚德靜，李慶偉，崔喬，等.靈芝多糖SeGLP－1抗氧化與抗腫瘤作用的研究［J］.營養(yǎng)學(xué)報，2002，24(3):249－251.

［6］張宏蓮，傅中滇，陳婉蓉.硒云芝多糖對小鼠臟器組織及全血抗氧化能力的影響［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2001，19(3):192 －194.

［7］ XU C L，WANG Y Z，JIN M L，et al.Preparation，characterization and immunomodulatory activity of selenium－enriched exopolysaccharide produced by bacterium Enterobacter cloacae Z0206［J］.Bioresource Technology，2009，100(6):2095 －2097.

［8］WANG L，WANG G Y，ZHANG J J，et al.Extraction optimization and antioxidant activity of intracellular selenium polysaccharide by Cordyceps sinensis SU －02［J］.Carbonhydrate Polymers，2011，86(1):1745 －1750.

［9］ZHU M L，LIU A J，ZHANG X L，et al.Protective effect of cartilage－selenium polysaccharide on diethylnitrosamine－induced liver injury in mice and its possible mechanisms［J］.Food Science and Technology Research，2009，15(3):249 －254.

［10］徐春蘭，欽傳光，朱衛(wèi)寧，等.硒化殼聚糖的制備及其體外抗氧化活性研究［J］.化學(xué)與生物工程，2009，26(9):45－48.

［11］曲韻笙，朱連勤.殼聚糖硒對小鼠的抗氧化作用研究［J］.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2009，26(1):12－14.

［12］蔣京，廖寶涼.N－含硒殼聚糖衍生物的合成、表征及其生物活性［J］.廣東微量元素科學(xué)，2000，7(5):14－17.

［13］劉有芹，楊慶輝，黃函，等.紫外分光光度法測定枸杞子、陳皮、生姜中硒含量［J］.理化檢驗:化學(xué)分冊，2010，46(3):329 －330.

［14］范冠宇，謝虹，吳志剛.水溶性幾丁聚糖對羥自由基的清除作用［J］.中國公共衛(wèi)生，2006，22(6):676－677.

［15］張縱圓，張玲，彭秧.紫花苜蓿中單寧的提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化作用研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(1):198－200.

Research of Synthesis and Antioxidant Activity of Chitooligosaccharide－selenium

JIN Li－ ming1，HAO Miao2，ZHAO Xiao － jing1，LI Chun －bin1，QI Xiao －h(huán)ui1，F(xiàn)AN Sheng －di1
(1.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China;
2.Dalian Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Dalian Liaoning 116021，China)

Sodium selenite and chitooligosaccharide were used to synthesize chitooligosaccharide－ selenium in this experiment by chemical method.The yield was 37.26%and the content of selenium was 9.02 mg/g.Chitooligosaccharide－selenium was characterized by visible ultraviolet(UV －VIS)and infrared(IR)techniques.The results proved the successful synthesis of chitooligosaccharide－selenium.The antioxidant activities in vitro of chitooligosaccharide－selenium was investigated by phenanthroline－Fe2+，pyrogallol autoxidation and T －AOC kit.The results showed that in the setting concentration range，the antioxidant activities increased with the elevation of concentration.The antioxidant activities of chitooligosaccharide－selenium were better than that of chitooligosaccharide.The clearance rates of hydroxyl free radical and superoxide anion of 1mg/mL chitooligosaccharide－selenium were 40.27%and 38.68%，and the total antioxidant activity was 0.617 Unit/mL.This research was an important step as means of laying the foundation for further research on low toxicity and effective organic selenium products.Key words:chitooligosaccharide;chitooligosaccharide－selenium;synthesis;characterization;antioxidant activity

R96

A

1009－315X(2012)05－0445－04

2012－02－16;最后

2012－07－02

國家自然科學(xué)基金項目(20872013);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目(DC110318，DC10040108)。

金黎明(1979－)，女，黑龍江牡丹江人，副教授，博士，主要從事生物活性物質(zhì)研究。

(責(zé)任編輯 鄒永紅)