大氣壓冷等離子體提高乙醇轉化率的實驗參數優化研究

董曉宇*，王 蕭，劉 超，劉慶平，馮寶民

（大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622）

大氣壓冷等離子體提高乙醇轉化率的實驗參數優化研究

董曉宇*，王 蕭，劉 超，劉慶平，馮寶民

（大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622）

以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為研究對象，研究大氣壓冷等離子體激活釀酒酵母提高乙醇轉化率的工藝條件。在單因素實驗基礎上，選取等離子體處理時間、等離子體電源電壓和處理菌液體積為影響因子，以乙醇轉化率為響應值，應用Box-Behnken中心組合實驗建立數學模型，進行響應面分析。結果表明，大氣壓冷等離子體提高乙醇轉化率的最佳實驗參數為：處理時間1 min，電源電壓24 V，處理菌液體積9 mL。在此條件下，乙醇轉化率達到0.58 g/g，比未處理過的釀酒酵母發酵葡萄糖生成乙醇的轉化率高23.6%。

大氣壓冷等離子體；釀酒酵母；乙醇轉化率；響應面

隨著世界化石燃料儲備量的日益減少，利用微生物轉化生物質生產燃料乙醇是解決未來能源短缺的一條重要出路[1]。與傳統化學法相比，微生物發酵法制取乙醇具有綠色環保，充分利用農作物廢棄物等優點，從而對節約能源和保護環境意義重大。但是在發酵過程中，由于底物和產物的抑制，引起菌種活力下降，從而導致乙醇轉化率降低[2]。因此，如何保持菌種在發酵中的活力是發酵工程急需解決的問題之一。

大氣壓冷等離子體是一種新興的綠色生物技術[2]，其含有多種活性成分，如高能電子、離子、分子、中性原子、激發態原子、光子和自由基[3]，同時具有物理活性和化學活性。由于其具有高活性、安全無污染、操作簡便、費用低等優點，近年被廣泛應用于微生物領域的消毒滅菌和誘變研究[4,5]。

我們前期研究表明，大氣壓冷等離子體可以促進克雷伯氏桿菌生長，從而提高1,3-丙二醇產量和生產強度[6]。因此，本文擬將其作為一種提高菌種活力的方法應用到乙醇的生物轉化中。但是，等離子體放電參數不同，其成分也各不相同[7]，對生物體產生的生物學效應也不一樣，如對細胞的滅活效應[8]、誘變效應[9]和激活效應[10]。因此，本文通過響應面分析法優化大氣壓冷等離子體放電的物理參數，確定提高釀酒酵母乙醇轉化率的最佳放電參數，為實現大氣壓冷等離子體在發酵過程中的自動控制提供數據基礎。

1 實驗部分

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.604），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養基

YPD培養基（g/L）：葡萄糖20 g，蛋白胨20g，酵母粉10 g，固體培養基加入瓊脂20 g，pH＝7.0，滅菌15 min。

發酵培養基（g/L）：葡萄糖160 g，蛋白胨20 g，酵母粉10 g，pH＝7.0，滅菌15 min。

1.2 儀器設備

GC-14B氣相色譜儀（日本島津公司），SBA-40C測糖儀（山東省科學院生物研究所），721分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌培養方法

將斜面保藏的釀酒酵母接種到YPD固體培養基進行活化培養，30 ℃培養24 h，使用接菌環取一環菌接入YPD培養基，30 °C、170 rpm振蕩培養至對數生長期，稀釋菌液使其OD600=3.0，用于等離子體誘導。

1.3.2 等離子體誘導過程

本文采用的介質阻擋放電（Dielectric Barrier Discharge，DBD）實驗裝置類似先前文獻報道[6]，略加修改，如圖1所示。

圖1 大氣壓介質阻擋放電等離子體實驗裝置示意圖

等離子體放電裝置由電源部分和反應器部分組成。電源部分由信號發生器（Peak Tech 4080 Function Generator with Frequency Counter）、放大器和變壓器組成。電源為頻率和電壓連續可調的正弦交流電源，最高峰值電壓為20 kV，最高頻率為20 kHz。反應器部分由不銹鋼的反應腔（20 cm × 20 cm × 20 cm）和尺寸不同的覆有石英介質的圓形不銹鋼平板電極組成。上電極直徑45 mm，與高壓電源相連；下電極又稱地電極，直徑60 mm，與不銹鋼腔體接觸并接地。下電極上放置一個直徑為7 cm的培養皿，菌液量3 mL，上電極與菌液表面之間放電間隙3 mm。當電壓、頻率及放電間隙適當時，電極間氣體可在大氣壓下被擊穿，形成介質阻擋放電等離子體。

1.3.3 搖瓶發酵

將經等離子體誘導過的菌液按1%（v/v）的接種量接入發酵培養基中，30 °C、170 rpm振蕩培養18 h。

1.4 實驗設計

1.4.1 單因素實驗

采用單因素實驗考察處理時間（min）、處理電壓（V）以及處理菌液體積（mL）對乙醇轉化率的影響。通過單因素實驗確定中心組合實驗的中心點，該中心點一般選擇的是使轉化率（g/g）最高的變量值。

（1）處理時間對乙醇轉化率的影響

等離子體放電電壓為25 V，處理菌液體積為3 mL，處理時間分別為0、1、2、3、4、5 min。誘導的菌液按照1%的比例接入含16%葡萄糖的YPD培養基中進行搖瓶培養。

（2）處理電壓對乙醇轉化率的影響

處理時間為上述（1）實驗得到的最佳值，處理菌液體積為3 mL，處理電壓分別為0、22、24、25、26、28、30 V。誘導后的菌液按照1%的比例接入16%葡萄糖的YPD培養基中進行搖瓶培養。

（3）處理菌液體積對乙醇轉化率的影響

等離子體處理時間和處理電壓均為上述（1）（2）實驗所得到的最佳值，處理菌液體積分別為1、3、5、7、9、11、13 mL。誘導后的菌液按照1%的比例接入16%葡萄糖的YPD培養基中進行搖瓶培養。

1.4.2 中心組合實驗

根據單因素實驗結果，采用三因素中心組合設計，以等離子體處理時間、等離子體放電電壓和處理菌液體積為主要考察因子，分別以X1、X2、X3表示，并以+1、0、-1分別代表上水平、基準水平、下水平。

中心組合設計的統計模型可以應用多元二次多項式方程表示：

式中，Y以乙醇轉化率為指標。

1.5 分析方法

生物量測定：比色法測定菌液OD值，即721分光光度計在600 nm處吸光度值。

葡萄糖含量測定：SBA-50B生物傳感器進行測定。

乙醇含量測定：采用氣相GC-14B型氣相色譜儀內標法測定。玻璃管填充柱，色譜柱2 m × Ф5 mm，填料為Chromsorb 101，檢測器為FID，柱溫170 °C，汽化室的溫度為200 °C，檢測器的溫度為220 °C，載氣為N2，流速40 mL/min，進樣量1 μL。采用無水乙醇和正丁醇做標準曲線，依據標準曲線計算樣品中乙醇濃度。

所有數據是三次實驗的平均值。

2 結果與討論

2.1 單因素考察

2.1.1 不同處理時間對釀酒酵母乙醇轉化率的影響

大氣壓冷等離子體處理時間對激活釀酒酵母乙醇轉化率的影響如圖2所示。從圖中可以看出，不同處理時間的釀酒酵母菌液經18 h發酵后，其乙醇轉化率出現不同程度的提高。當處理時間是3 min時，釀酒酵母乙醇轉化率最高，為0.50 g/g。因此，在后面的單因素實驗中，等離子體激活釀酒酵母的最佳處理時間選擇為3 min。

2.1.2 不同電源電壓對釀酒酵母乙醇轉化率的影響

大氣壓冷等離子體不同電源電壓對釀酒酵母乙醇轉化率的影響如圖3所示。大氣壓冷等離子體電源電壓分別為0、22、24、25、26、28、30 V，經等離子體誘導后的釀酒酵母菌液發酵培養18 h后，其乙醇轉化率各不相同。當電源電壓為26 V時，釀酒酵母乙醇轉化率最高，為0.53 g/g。因此等離子體激活釀酒酵母的最佳放電電壓為26 V。

2.1.3 不同體積菌液對釀酒酵母乙醇轉化率的影響

大氣壓冷等離子體處理不同體積的釀酒酵母菌液發酵培養18 h后，菌液體積對乙醇轉化率的影響如圖4所示。從圖中可以看出，當處理菌液體積為5 mL時，釀酒酵母乙醇轉化率最高，為0.52 g/g。因此等離子體激活釀酒酵母的最佳菌液體積為5 mL。

2.2 響應面法優化

2.2.1 中心組合實驗

根據單因素實驗結果，以處理時間3 min，處理電壓26 V，處理菌液量5 mL作為中心點，將其設置為0，進行三因素三水平的實驗設計，共20組實驗，變量水平設定見表，實驗設計及結果見表1。

圖2 不同處理時間對釀酒酵母乙醇轉化率的影響

圖3 不同處理電壓對釀酒酵母乙醇轉化率的影響

圖4 不同菌液體積對釀酒酵母乙醇轉化率的影響

表1 中心組合實驗變量水平設定

運用Design expert 7.0.1.0軟件設計實驗組合，如表2所示，按照表中組合進行實驗，結果以乙醇轉化率形式呈現于表2。

表2 中心組合設計及結果

表3 響應面分析法實驗回歸分析的結果

對表3的數據進行二次多項式擬合，獲得處理時間、處理電壓、處理菌液體積對乙醇轉化率的二階回歸方程：

式中Y為乙醇轉化率（g/g）的預測值，X1、X2、X3為處理時間、處理電壓、處理菌液體積3個變量的編碼值。對該方程進行方差分析得知，該模型極顯著（P＜0.0001），模型的校正系數為0.8297，說明該模型能解釋82.97%響應值的變化，復相關系數為0.6751說明該模型的擬合度較好，實驗誤差較小，可用此模型對等離子體激活酵母發酵的實驗參數進行分析和預測。

圖5表示處理時間和處理電壓對乙醇轉化率的影響。圖5（a）表示當處理菌液體積確定，處理時間在1 min左右，處理電壓在23～25 V之間時，等離子體激活釀酒酵母發酵葡萄糖生成乙醇的轉化率最大；從圖5（b）中可以看出當處理電壓一定時，處理時間增長，乙醇轉化率降低，當處理時間一定時，處理電壓低于23 V時，處理電壓減弱，乙醇轉化率降低，處理電壓高于25 V時，處理電壓增強，乙醇轉化率降低。

圖6表示處理時間和處理菌液體積對乙醇轉化率的影響。圖6（a）表示當處理電壓確定，處理時間1 min左右，處理菌液體積9 mL左右時，等離子體激活釀酒酵母發酵葡萄糖生成乙醇的轉化率最大；由圖6（b）等高線圖可以看出，乙醇轉化率隨著處理時間的增長以及處理菌液體積的減少而降低。

圖7表示處理電壓和處理菌液體積對乙醇轉化率的影響。圖7（a）當處理時間確定，處理電壓在22～24 V，處理菌液體積在9 mL左右時，等離子體激活釀酒酵母發酵葡萄糖生成乙醇的轉化率最大；圖7（b）表示，當處理電壓一定時，乙醇轉化率隨處理菌液體積的減少而降低，當處理菌液體積一定時，乙醇轉化率隨處理電壓的升高而降低。

由響應面的三維立體圖和響應面的等高線圖可以看出三因素對乙醇轉化率的影響都比較顯著，每兩個因素之間都存在較明顯的交互作用。

根據Design expert 7.0.1.0軟件對數據的整理得出，當處理時間為1 min，處理電壓為23.4 V，處理菌液體積為9 mL時，等離子體激活釀酒酵母發酵葡萄糖生成乙醇的轉化率最高，為0.57 g/g。考慮到實際操作，確定最適方案為：處理時間為1 min，處理電壓為24 V，處理菌液體積為9 mL。

圖5 等離子體處理時間與處理電壓交互作用對乙醇轉化率的影響

圖6 等離子體處理時間與處理菌液體積交互作用對乙醇轉化率的影響

圖7 等離子體處理電壓與處理菌液體積交互作用對乙醇轉化率的影響

2.2.2 搖瓶驗證實驗

為了確定建立的模型與實驗結果的相符程度，通過進一步的搖瓶實驗對模型適用度進行驗證。驗證實驗中，各因素取值分別為：處理電壓為24 V，處理菌液體積為9 mL，處理時間為1 min。等離子體激活釀酒酵母的其它參數相同，進行搖瓶實驗，三次實驗乙醇轉化率的平均值為0.58 g/g。處理時間為1 min時，實驗結果與模型計算值相差2.05%，如圖8，說明模型是比較可靠的。該實驗證明用響應面法來優化等離子體提高乙醇轉化率的實驗參數是可行的。

圖8 搖瓶驗證實驗

隨著能源資源的缺乏，微生物轉化生產生物質能源日益受到推崇。但是，在發酵過程中菌種活力下降仍是該領域急需解決的問題之一。為了提高微生物發酵目標產物濃度，研究人員采用不同方法來提高菌種活力，如誘變篩選高產乙醇的菌株[11]，構建基因工程菌[12]，以及人工代謝調控微生物發酵[13]等。目前，采用大氣壓冷等離子體激活酵母菌發酵生產乙醇的研究還未見報道。我們前期研究表明，大氣壓介質阻擋放電等離子體可以激活克雷伯氏菌生長，從而縮短發酵周期，提高克雷伯氏菌生產1,3-丙二醇強度[6]。而且，隨著大氣壓介質阻擋放電等離子體處理時間的延長，克雷伯氏菌細胞外殼上的大分子，如多糖和蛋白，被降解為小分子[14]。細胞外殼組分變化會影響細胞膜通透性，膜通透性改變直接影響細胞生理活動，最終引起代謝產物的變化[15]。研究證明，大氣壓冷等離子體炬可以誘導細胞膜通透性的瞬間提高[16]。綜上所述，我們推斷大氣壓冷等離子體可能是改善釀酒酵母細胞膜通透性，從而提高乙醇轉化率。

等離子體放電效果受多種因素影響，如放電電壓、放電間隙和處理菌液體積等。因此，本研究通過響應面法優化等離子體提高乙醇轉化率的最佳實驗參數。但是，通過響應面法得到的最佳參數與單因素實驗中所得到的中心值偏差較大，其中單因素實驗中得出的最佳處理時間為3min，最佳處理電壓為26 V，最佳處理菌液體積為5 mL，而響應面法得出的最佳處理時間1 min，處理電壓24 V，處理菌液體積為9 mL。造成這種結果的原因可能有如下幾點：

（1）利用響應面法優化的大氣壓冷等離子體激活釀酒酵母的三個參數之間是相互作用的。當處理的菌液體積增加時，兩個電極之間的介質厚度增加，會影響放電強度。

（2）本實驗所用的等離子體裝置是直接暴露于室溫空氣中的，放電效果受到諸多環境因素的影響，如空氣的濕度、環境溫度、菌液濃度等，從而影響實驗效果。

（3）實驗操作過程中出現的誤差，如當電壓較低時，對放電間隙的精確度要求就很嚴格，間隙調不準就會造成放電強度過大或不放電。這也反映了本實驗所用的大氣壓冷等離子體裝置有待進一步完善。

綜上所述，雖然等離子體激活釀酒酵母發酵提高乙醇轉化率的應用還存在諸多問題。但是，在特定條件下，大氣壓冷等離子體對釀酒酵母的激活效應是毋庸置疑的。因此，不斷完善等離子體激活微生物發酵的裝置和優化等離子體激活微生物的實驗參數，將大氣壓冷等離子體發展成為一種提高微生物發酵的新型方法是今后研究的主要方向。大氣壓冷等離子體具有高效、低溫、綠色環保等優點，必將在微生物發酵工程領域具有廣闊的應用前景。

3 結論

通過響應面法優化大氣壓冷等離子體提高乙醇轉化率的最佳實驗參數，實驗結果表明，當大氣壓冷等離子體處理時間1 min，處理電壓24V，處理菌液體積9 mL，放電間隙3 mm，電流1.6 A時，釀酒酵母發酵葡萄糖的乙醇轉化率最高，達到0.58 g/g，比未經等離子體處理過的釀酒酵母乙醇轉化率高23.6%。

感謝大連理工大學修志龍教授及其課題組全體人員在實驗中給予的幫助。感謝華中科技大學盧新培教授提供的等離子體相關文獻。

[1] 張寧, 蔣劍春, 李翔宇, 等. 我國非糧燃料乙醇產業發展現狀及前景展望[J]. 生物質化學工程, 2011, 45(4): 47-50.

[2] 趙寶華, 張莉. 外加肌醇和鈣離子對釀酒酵母乙醇發酵的影響[J]. 微生物學報, 1999, 39(2): 174-177.

[3] 董曉宇, 李爽, 侯英敏, 等. 大氣壓冷等離子體誘變產1,3-丙二醇菌株Klebsiella pneumonia [J]. 過程工程學報, 2008, 8(3): 555-560..

[4] LIANG Y, WU Y, SUN K, et al. Rapid inactivation of biological species in the air using atmospheric pressure nonthermal plasma [J]. Environmental Science and Technology, 2012, 46(6): 3360-3368.

[5] WANG LY, HUANG Z L, LIG, et al. Novel mutation breeding method for Streptomyces avermitilis using an atmospheric pressure glow discharge plasma [J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 108(3): 851-858.

[6] DONG X Y, XIU Z L, HOU YM, et al. Enhanced production of 1,3-propanediol in Klebsiella pneumoni -ae induced by dielectric barrier discharge plasma in atmospheric air [J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2009, 37(6): 920-926.

[7] LU X P, YE T, CAO YG, et al. The roles of the various plasma agents in the inactivation of bacteria [J]. Journal of Applied Physics, 2008, 104(5): 0533091-0533095.

[8] DAESCHLEIN G, SCHOLZ S, WOEDTKE T, et al. In vitro killing of clinical fungal strains by low-temperature atmospheric-pressure plasma jet [J]. 2011, 39(2): 815-821.

[9] DONG X Y, XIU Z L, LIS, et al. Dielectric barrier discharge plasma as a novel approach for improving 1,3-propanediol production in Klebsiella pneumoniae [J]. Biotechnology Letters, 2010, 32(9): 1245-1250.

[10] TIPA R S, KROESEN G M W. Plasma-stimulated wound healing [J]. IEEE Intransaction on Plasma Science, 2011, 39(11): 2978-2979.

[11] ZHANG Q, FU Y, WANG Y, et al. Improved ethanol production of a newly isolated thermotolerant Saccharomyces cerevisiae strain after high energy pulse electron beam [J]. Journal of Applied Microbiology, 2012, 112(2):280-288.

[12] MATSUDA F, FURUSAWA C, KONDO T, et al. Engineering strategy of yeast metabolism for higher alcohol production [J]. Microbial Cell Factories, 2011, 10(70): 1-10.

[13] LIJ, HUANG W, WANG X, et al. Improvement of alcoholic fermentation by calcium ions under enological conditions involves the increment of plasma membrane H+-ATPase activity [J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010, 26(7): 1181-1186.

[14] HOU YM, DONG X Y, YU H, et al. Disintegration of biomacromolecules by dielectric barrier discharge plasma in helium at atmospheric pressure [J]. IEEE transactions on plasma science, 2008, 36(4): 1633-1637.

[15] 魏娜, 李柏林, 歐杰. 細胞膜通透性調節在發酵代謝中的重要性 [J]. 食品科技, 2006, 31(9): 14-16.

[16] YONSON S, COULOMBE S, LEVEILLE V, et al. Cell treatment and surface functionalization using a miniature atmospheric pressure glow discharge plasma torch [J]. Journal of Physics D: Applied Physics, 2006, 39(16): 3508-3513.

Optimization of Experimental Parameters for Improved Ethanol Yield by Cold Plasma at Atmospheric Pressure

DONG Xiao-yu*, WANG Xiao, LIU Chao, LIU Qing-ping, FENG Bao-min
(College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China)

Process conditions were investigated to improve ethanol yield in Saccharomyces cerevisiae by cold plasma at atmospheric pressure. According to single factor investigation, a mathematical model was established using Box-Behnken central composite experimental design, with treated time of plasma discharge, supply voltage, and treated volume of cell suspension as the impact factors and with ethanol yield as their response. This was followed by response surface analysis. It was found that the optimal process conditions for enhanced ethanol yield in Saccharomyces cerevisiae by plasma discharge were as follows: treated time 1 min, supply voltage 24 V, treated volume of cell suspension 9 mL, and that the resultant ethanol yield was 0.58 g/g with an increase of 23.6% compared to the control.

cold plasma at atmospheric pressure; Saccharomyces cerevisiae; response surface; yield of ethanol

TQ923

A

1008-2395(2012)03-0037-07

2012-03-13

遼寧省科學事業公益研究基金項目（201149）；遼寧省教育廳科學研究一般項目（2011173）；大連大學博士啟動基金項目（0302329）。

董曉宇（1973-），女，博士，講師，研究方向：生物化工和食品化工，等離子體生物學與生物技術，Email: dongxiaoyu@dlu.edu.cn。