人Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子抗腫瘤作用研究進展

馮 潔，倫永志*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622;

2. 大連大學 醫學院 遼寧省高校生物物理學重點實驗室, 遼寧 大連 116622）

人Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子抗腫瘤作用研究進展

馮 潔1，倫永志2*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622;

2. 大連大學 醫學院 遼寧省高校生物物理學重點實驗室, 遼寧 大連 116622）

圍繞人Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子的結構、主要成員及其抗腫瘤作用做一綜述。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子在機體內發揮重要的生理作用，具有廣泛的研究和應用價值。它們在各種腫瘤中有著或高或低的表達，與腫瘤發生、發展相關，可能成為腫瘤治療的新標靶。

Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子；結構；抗腫瘤作用

癌癥病變過程中最重要的步驟是腫瘤細胞的浸潤和轉移，其關鍵取決于腫瘤細胞的某種分泌物能夠水解細胞外基質（Extra Cellular Matrix，ECM）和基底膜（Basement Membranem，BM）。腫瘤細胞先分泌尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type Plasminogen Activator，uPA），此激活物為一種絲氨酸蛋白酶，可激活纖溶酶原產生纖溶酶（Plasmin，PLM）；PLM繼而降解ECM，同時還能激活前基質金屬蛋白酶成為基質金屬蛋白酶，后者參與細胞外基質蛋白的水解作用；最終ECM與BM被水解，腫瘤細胞得以擴散。因此，絲氨酸蛋白酶抑制劑可以從源頭抑制腫瘤轉移。

絲氨酸蛋白酶抑制因子（Serine Proteinase Inhibitors, Serpin）廣泛存在于各生物體內。Serpin在生物體內有著很重要的作用，如保護神經作用；對抗有害生物破壞；吸血昆蟲體內的抗凝血作用[1]等。已在細菌、病毒、真核生物中發現并鑒定了500多種類型Serpin。Serpin是單肽鏈的球蛋白，各種Serpin有30%左右的同源序列，疏水區同源性約70%。常見的類型包括Kazal型、Kunitz型、α-巨球蛋白、Bowman-Brik、pacifastin家族等。Kazal型Serpin較為保守，是由Kazal發現并命名的一種胰蛋白酶抑制因子，主要存在于哺乳動物中，目前已發現100多種，多為小分子多肽，大多能夠抑制腫瘤細胞的增殖和活性[1]。越來越多的研究顯示Kazal型Serpin家族某些成員參與調節腫瘤細胞的侵襲與轉移，影響腫瘤細胞因子和信號轉導途徑中細胞因子的表達，從而成為腫瘤治療的新標靶。盡管Kazal型Serpin較為保守，但由于其承受殘酷的進化壓力，其活性部位高度易變，導致功能的多樣性且有些抑制劑已喪失原有功能，給研究帶來極大挑戰[2]。

1 結構特征

Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子由一個或多個保守的Kazal結構域組成，其間由肽段相連。典型的Kazal結構域如圖1。

圖1 Kazal結構域保守序列

如圖1所示，Kazal結構域中的某些氨基酸非常保守，但大部分仍高度可變的。結構域中含有6個半胱氨酸，第1、5；2、4；3、6之間形成三對二硫鍵。三對二硫鍵對維持抑制因子的抑制活性至關重要，高溫和二硫蘇糖醇（Dithiothreitol, DTT）作用可使二硫鍵失去抑制活性[1]。無脊椎動物中Kazal結構域缺乏特定的二硫鍵而被稱為非典型Kazal結構域。Kazal結構域的二級結構由一個螺旋和三個反向平行的折疊組成，其結構可以看做由A、B、C三個環構成，其中B環含有決定抑制特異性的P1位點（如圖1所示）。P1位點位于第二個半胱氨酸后第二位。P1位點的不同氨基酸決定了Kazal型Serpin抑制不同的蛋白酶[3]。

2 主要成員

Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子（Serine Protease Inhibitor kazal type, SPINK）家族與胰腺炎或胰腺癌、肝癌、食管癌等疾病關系密切。目前已發現SPINK1、SPINK2、SPINK4、SPINK5、SPINK6、SPINK7等多個亞族。表1為SPINK家族基因及蛋白特征的介紹，表2是人SPINK家族蛋白在哺乳動物中的分布情況及功能的介紹[4]。

表1 SPINK家族基因及蛋白特征

表2 人SPINK家族蛋白在哺乳動物中的分布及功能

2.1 SPINK1

SPINK1又稱PST1，分子量為7.5 kb，是Horii A于1987年分析大量遺傳性胰腺炎患者時發現的，將其命名為SPINK1。

Bimaljit Sandhu等研究報道胰腺炎/胰腺癌患者中N34S突變頻率較高[5]，但并非所有此位點突變的人都患有慢性胰腺炎或胰腺癌，推斷N34S在慢性胰腺炎/胰腺癌病發中可能起重要作用，卻不是最關鍵的一個位點，即其可能與其它位點突變共同作用引發疾病。張敏等[6]證實了囊性纖維跨膜轉運調節因子(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductancere Gulator，CFTR）及SPINK1與慢性胰腺炎及胰腺癌相關。正常胰腺中CFTR、SPINK1蛋白陽性表達，陽性率都為100%。部分慢性胰腺炎細胞或組織中可見CFTR、SPINK1表達，陽性表達率分別為50%、55%。胰腺導管癌細胞中偶見CFTR、SPINK1表達，陽性表達率分別為10%、6.7%。結果顯示CFTR、SPINK1蛋白在慢性胰腺炎和胰腺癌中表達丟失，這種異常可能與二者發生發展有著一定關系。由于CGTR功能不全，離子分泌障礙，導致分泌液PH值下降。酸性條件下引起組織炎癥損害的同時，可導致胰酶分泌及激活的異常，使胰腺的纖維化及功能不全。SPINK1蛋白則可能作為一種修飾因子，降低胰腺癌發病的閾值或與其它基因共同促進胰腺癌發生，也可能由于細胞癌變使SPINK1表達發生變化。

研究發現部分前列腺癌患者[7]和乳腺癌患者[8]腫瘤組織中SPINK1高度表達，正常組織中則不存在。利用免疫組織化學方法進行研究證明，SPINK1可影響乳腺癌腫瘤細胞的侵襲性：影響它們的增殖，擴散和對藥物的抗性[8]。現已對其作用機制等進行研究，希望SPINK1可成為治療前列腺癌、乳腺癌的標靶，或用于早期診斷。

2.2 SPINK6

SPINK6又稱EG433180，是2009年復旦大學的黃青山教授研究細小病毒抗腫瘤作用時發現的，SPINK6能有效針對原發性肝癌中的癌細胞轉移、復發機制，起到抑制腫瘤細胞的浸潤和轉移的作用。其作用原理尚處于實驗觀察、初步探索階段，推測SPINK6可能通過影響抑癌基因p53來抑制腫瘤細胞惡性增生；或是通過調節細胞粘附力和運動能力抑制腫瘤細胞浸潤、轉移。

較新的研究發現，肝內淋巴細胞中二肽基肽酶I的表達會產生顆粒酶B和穿孔素，顆粒酶是外源性的絲氨酸蛋白酶，進入靶細胞可介導細胞凋亡。穿孔素可使顆粒酶進入靶細胞，引起靶細胞凋亡。SPINK6、SPINK9可抑制顆粒酶B和穿孔素。SPINK6、SPINK9在免疫細胞（如抗原呈遞細胞、細胞毒性T淋巴細胞等）中表達，可抵制顆粒酶B的活性；在腫瘤細胞或病毒性感染的肝病中表達可使腫瘤細胞和病毒等被細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞殺死。目前的研究將主要集中在肝淋巴細胞中顆粒酶B的活性和SPINK6、SPINK9表達之間存在的關聯[9]。

激肽釋放酶（Kallikrein, KLK）相關的肽酶是一類絲氨酸蛋白酶，Shigemasa K等發現KLK11在卵巢癌中的過度表達可能導致腫瘤細胞的增殖、擴增、轉移[10]。最近，Tomasz Kantyka等研究發現SPINK6可抑制KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK12、KLK13、KLK14，其中對KLK6活性影響較大，其次是KLK4，但對KLK1、KLK3、KLK8和KLK11無明顯抑制作用[11]。

2.3 SPINK7

SPINK7也稱ECRG2（Esophageal Carcinoma Related Gene 2, ECRG2），是1998年陸士新等利用mRNA差異顯示技術，從食管癌腫瘤組織中篩選、克隆所得的基因。基因cDNA全長572 bp，開放閱讀框長258 bp，分子量為9.2 kD[12]。

SPINK7在成人正常食管組織中表達較高，在食管癌組織及其周邊組織中表達較低或不表達。李美寧等研究證明，轉染SPINK7表達蛋白可抑制EC9706細胞惡性增殖能力，并能部分逆轉其惡性表型（停泊－非依賴性），通過Western Blotting檢測發現，細胞轉染ECRG2基因后，p53、p21蛋白表達升高[13]。實驗證明，DNA損傷后，信號傳導至p53蛋白，激活p53，延長其半衰期，促進p53下游靶基因p21轉錄。p21蛋白可與多種Cyclin、Cdk復合物（如CyclinD1-Cdk4、CyclinE-Cdk2等）結合，而后可抑制CyclinE-Cdk2、CyclinA-Cdk2的H1激酶活性，使細胞周期阻滯于G1期，使DNA損傷得以恢復，減少突變發生。另外，p21可以結合到增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)的C端，形成p21-PCNA復合體，抑制細胞的過度增殖[14]。

在腫瘤細胞中共轉染SPINK7 cDNA、金屬硫蛋白（Metallothionein, MT），二者相互作用，調控相關的信號通路，抑制腫瘤細胞增殖，并誘發腫瘤細胞凋亡。另外，對SPINK7基因進行篩查發現，在其3’非編碼區存在一短小重復序列，其多態性與食管癌的易感性有關[13]。以上的研究證實了SPINK7與食管癌的發生密切相關。

2.4 Maspin

Maspin（Mammary Serine Proteinase Inhibitor）又稱SERPINB5，是1994年Zou等通過消減雜交技術，從人正常乳腺上皮細胞中分離出的一種新基因，此基因cDNA全長2584 bp，定位于人染色體18q21.3～q23區，約1 kb的啟動子區域存在多個轉錄因子結合位點，包括Ets，AP1，HRE及p53一致性結合位點，p53與p53一致性結合位點結合后可活化Maspin啟動子，促進轉錄，突變型p53則失去此作用[15,16]。

Maspin對腫瘤具有抑制作用，包括抑制腫瘤浸潤、轉移，誘導細胞凋亡的作用。Liu J等發現Maspin可增加細胞對凋亡刺激的敏感性。此外，Maspin還具有轉錄調節的作用，其在正常和癌變乳腺上皮細胞的差異表達是在轉錄水平進行調節的。乳腺癌腫瘤發展期Maspin表達缺失或部分缺失，Maspin啟動區內Ets和AP1-DNA結合的位點轉錄缺失導致Maspin表達消失或下降；Maspin啟動區異常胞嘧啶甲基化作用和染色質凝聚導致Maspin基因表達沉默[17]。故在多種腫瘤組織中（如乳腺、卵巢、頭部和頸部、胃、結腸等）Maspin表達下調，然而在胰腺癌組織中，卻檢測到Maspin的高表達，正常組織則相反。Cao D等利用免疫組織化學和高吞吐率的組織微陣列法進行研究，在223例切除胰腺癌腫瘤的外科手術中，觀察發現maspin蛋白質幾乎都有表達，只有14例Maspin表達不明顯。剩余209例中有39例的腫瘤是良性未擴散的，170例的腫瘤已經擴散，擴散的病例中maspin的表達高于未擴散的病例[18]。Lockett等認為，在胰腺癌與其它癌癥中maspin表達不一致的這種矛盾與病變部位上皮細胞內微環境的不同有關。Maspin對上皮微環境極為敏感，表明其對上皮細胞微環境的穩態調節起作用[19]。此外，Lewis等的研究結果表明，當Maspin進入癌細胞的細胞核時，腫瘤細胞的擴散能力明顯受限，而當Maspin不是在細胞核中時，這種能力得到逆轉，癌細胞更容易擴散。

3 結語

Kazal型Serpin是人體內很重要抑制因子，近年來多項研究已證明多種Kazal型Serpin可作為腫瘤抑制基因負向調控腫瘤細胞的浸潤、轉移，誘導凋亡等過程。盡管目前發現的某些Kazal型Serpin作用機制尚不明確，但其仍可作為抑癌基因。腫瘤發展期各抑制因子表達的含量變化使其有望成為腫瘤診斷及評估預后的標志物。可以通過某些藥物使抑制因子再表達或是降低含量，來影響腫瘤細胞的增殖、轉移。另外，多種Kazal型Serpin存在于正常人體內，具有相對較高的生物安全性，且其多數分子量小，易于重組表達或人工合成，有利于對其進行深入研究。

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Progresses in Anti-tumor Effects of Human Kazal-type Serine Protease Inhibitor

FENG Jie1, LUN Yong-zhi2*

(1. College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China;
2. Medical College, Liaoning Provincial University Key Laboratory of Biophysics, Dalian University, Dalian 116622, China)

This paper reviews the structures, key members and anti-tumor effects of human Kazal-type serine protease inhibitors. Kazal-type serine protease inhibitors play an important role in physiology, and also have extensive value of research and applications. They have a higher or lower expression levels in different types of tumor, and relate with initiation and development. They may become a new target for oncotherapy.

Kazal-type serine protease inhibitor; structure; anti-tumor effect

Q51

A

1008-2395(2012)03-0048-05

2012-04-13

大連市科技計劃項目（2010E13SF138）。

馮潔（1987-），女，碩士研究生。

倫永志（1973-），男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：感染性疾病的分子生物學。