保健功能食品衛生微生物學檢驗方法的探討

[摘要] 本文通過在培養基上具體實驗，對17種保?。üδ埽┊a品進行了方法學方面的驗證。深入研究保健（功能）食品微生物學在檢驗細菌、霉菌及酵母茵檢查方法方面的合理性。以此來探討目前我國微生物學驗證方法的合理性。

[關鍵詞] 微生物學檢驗；方法學驗證；中國藥典；食品安全

[中圖分類號] R446.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）33-0069-02

目前我國食品衛生在保證保?。üδ埽┦称返陌踩矫?，普遍采用的是微生物學檢驗，按照我國目前的食品衛生管理條例[1]，我國保健食品衛生應該采用微生物學檢驗，因此，為了全面了解國標（GB/T4789—2003）[2]方法驗證食品衛生微生物學檢驗是否具有合理性，研究人員依照《中國藥典》（2005年版）[3]微生物學驗證的相關要求入手研究，采用大腸桿菌和枯草桿菌在培養基里培養實驗并且采取微生物檢驗方法，對我國生產的一些保健食品進行驗證，其中包括各種型號的口服液、藥丸、沖劑等等，來探討保?。üδ埽┦称沸l生微生物學檢驗方法的重要性。通過幾種實驗的方法，有力地說明采用我國醫藥國家標準存在不完善的地方，同時對此提出一些合理的建議。

1 實驗材料

1.1 實驗樣品

牙周康膠囊、感冒軟膠囊、紳寧寶膠囊、天丹通絡膠囊、斯達舒膠囊、白伺丸膠囊、天然培旦陛牌70無蠟蜂膠液、復方蘆薈膠囊、清熱暗瘡膠囊、消炎靈膠囊、獨一味膠囊、糖尿樂膠囊、植物降糖膠囊、蝮蛇木瓜膠囊、坤復康膠囊、京都念慈庵靈芝蜜、頭孢地尼膠囊。

1.2 實驗用培養基

實驗用培養基包括酵母膏、葡萄糖培養基、高氏合成一號瓊脂、酵母膏、蛋白胨瓊脂、醋酸菌培養基、營養肉汁瓊脂、固氮菌培養基、玉米粉培養基、乳酸菌培養基Ⅱ、蛋白胨。

1.3 實驗用菌種

實驗用菌種包括大腸桿菌、沙門氏菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、福氏志賀氏和乙型溶血性鏈球菌。

2 實驗方法及結果

2.1 制備實驗用菌液

①先取在36℃環境中培養過的大腸桿菌、枯草桿菌、黑曲霉菌、福氏志賀氏肉湯培養物各3 mL，適當加鹽水20 mL，以20倍稀釋至（100～200）cfu/mL，用作活菌計數使用[4]。②在26℃環境溫度培養19～23 h的白色念珠菌，再取其改良馬丁培養液2 mL，緩慢加鹽水20 mL，20倍稀釋到（100～200） cfu/mL，用作活菌計數使用。③在26℃環境溫度培養黑曲霉菌培養物1周左右，然后緩慢加鹽水4～5 mL，吸取出黑曲霉菌的菌液，用標準比濁管比濁，當菌液濁度一定時，再取2 mL適當加鹽水20 mL逐管20倍稀釋至（100～200）cfu/mL，用作活菌計數來使用。

2.2 制備實驗用供試液

標準稱取樣品26 g，適當添加0.15%的氯化鈉稀釋到230 mL，制成1∶10供試液。

2.3 驗證酵母菌和霉菌數計數方法

①采用常規法 取先前配好的1∶10的供試液2 mL，在培養基上分別接種6株菌株60～80 cfu，然后再加16～22 mL的瓊脂培養基，等供試液凝固后再放置到規定的條件下培養，然后記錄實驗結果并且計算菌株的回收率，回收率的計算公式為：S=（W-H）/D*100%。S為加菌回收率，W為實驗組的平均菌落數，H為供試品對照組的菌落數，D為液組的平均菌落數。②采用培養基稀釋法 每個容器加入供試液0.3 mL，然后接種試驗菌株60～80 cfu，過30 min再加上瓊脂培養基18～22 mL，等培養液凝固后將其放置在規定的環境下培養。然后記錄實驗結果并且計算菌株的回收率，菌株的回收率計算公式跟上面采用常規的方法一樣[5，6]。

2.4 驗證控制菌檢查方法

保健類食品通用標準（GB-16740）中明確規定：保健菌應對大腸桿菌[CMCC（B）44102-22]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003-22]、溶血性鏈球菌[CMCC（B）32210-20]、志賀氏菌和沙門氏菌[CMCC（B）50094]等進行檢驗。分別取≤100 cfu/mL的菌懸液1 mL加入相應的檢驗對象的培養基中進行陽性對照，同時應設立不加有陽性菌的菌培養基作為實驗對照組與陰性菌作為對照，特別注意的是要對供試品進行驗證檢驗，確保其對檢驗結果無任何影響[7]。

2.5 實驗結果分析

鑒于我國的保健食品微生物污染問題比較突出，而植物降糖膠囊按國標的方法檢驗菌落數為0，但是采用薄膜稀釋卻為6000，檢測結果千差萬別，所以有些保健產品在控制菌檢查過程中存在漏檢、誤檢。這就充分說明了我國目前采用的方法驗證是不完善的。

2.6 實驗的注意事項

2.6.1 對檢驗人員的素質要求 保健功能的食品微生物檢測的工作中充滿了實驗性，食品微生物檢驗工作中對儀器和設備的標準也是非常多的，同時儀器和設備的正常運行也是檢驗工作能夠順利完成的必備條件。因此工作人員在實驗室中的儀器設備進行安裝、調試、檢驗和使用過程中都應嚴格按照規章制度執行，并確保所處環境符合要求。良好運行儀器和設備的同時還應注意對其進行保養，檢驗人員應定期進行檢查和維修，并在使用的過程中應做好監測、維修記錄，尤其要注意對儀器和設備的使用年期。

2.6.2 對儀器設備的要求 在食品微生物檢驗的過程中要保證所有藥品、試劑、培養基等符合要求，其藥品和試劑的純度必須在AR級以上，同時藥品和試劑的提供廠家必須具備專業素質，確保藥品和試劑等符合相關的質量標準，同時在儲存過程中應注意防潮、防結塊等。

溶劑使用過程中應注意：①溶劑的選取必須符合相關標準。②根據不同試劑的性質不同，應選擇不同的盛裝容器，對易揮發的試劑選擇的試劑瓶必須要帶塞，具有易分解性的試劑應選用深色試劑瓶，其中棕色瓶最佳。③對變質溶液應立即停止使用。培養基在配制過程中應注意：①必須在指定的容器中完成培養基制備工作。②培養基的配制過程中應嚴格按照檢驗項目的規定進行，不得隨意更改藥物的劑量。③配制培養基的水使用蒸餾水最佳。④配制培養基時應注意對pH值的調整，不同微生物的pH值情況不同。⑤注意培養基的存放工作，溫室條件下的有效期為2周。⑥為了確保使用的培養基符合要求，在使用之前應做無菌培養試驗和效果實驗。

3 保健食品微生物檢驗質量及意義

目前，致命菌和微生物引起的安全問題被認為是最重要的食品安全問題。據了解每年發生食物中毒的多達200萬人，主要由于食物不干凈或者食物中有害的微生物所導致的，因此對食品進行微生物檢驗是十分必要的。

3.1 食品微生物檢驗內容

食品微生物的檢驗主要是指對食品污染程度指示菌檢驗和食品中致病菌的檢測。其中污染程度的檢測主要是指食品及生活飲用水的污染程度，方法有兩種：①在一定條件下培養食品及飲用水的樣本，檢驗其含細菌菌落個數。②根據人類或畜生的糞便中的大腸桿菌在一定的存活環境，它能發酵乳糖、產配、氧氣的革蘭染色陰性無芽孢桿菌，根據糞便污染指標來評定生活食品及飲用水的衛生質量。食品中的致病菌包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌等，因此也應明確該類微生物的數量[8]。

3.2 實驗設施及環境

無菌實驗室的建設應符合GB19489的規定，特殊設備應放置在特殊環境下，應符合無回路的原則，在時間和空間上有效隔離各種檢測活動，確保檢測樣品的完整性，同時按操作規定程序應采取預處理措施。

通過以下方法可以有效地減少污染：①紫外線消毒法：用220 V、30 W的紫外線燈垂直照射在1 m高度處，輻射強度應高于70 μW/cm2，確保每立方米不少于1.5 W的紫外線光。②臭氧消毒法：在無人條件下，采用20 mg/m3濃度的臭氧作用30 min以上，使無菌室保持封閉狀態，在臭氧濃度≤0.2 mg/m2時再恢復作業。③物理方法：無菌室內應具有光滑的墻面、防滑地面并且墻、地、天花板間應有弧度連接；避免人為差錯的出現；防止異物或有毒害物質及微生物污染食品，實行全過程質量監控管理方式[9]。

3.3 生產過程中食品質量的控制措施

①在食品生產過程中應明確控制點、控制限值、監控對象、錯誤補救措施，不斷摸索生產過程中的質量和衛生關鍵，將關鍵點做好記錄。②生產人員和機械設施應具備對生產環境的適應能力，準確地控制生產過程中關鍵的環境溫、濕度和空氣凈化程度等指標，適時進行檢測并提供報告。③做好審核工作，產品質量監管部門應對產品進行抽查審核，對審核不合格的產品返工重新生產等。同時在生產過程中出現的異常情況應及時做好記錄并報告產品監管部門，產品管理部門應對不同的情況進行必要的調查并記錄等處理。

3.4 保健食品微生物檢驗的意義

目前我國保健食品微生物中存在的污染問題日益顯著，我們曾經對22中品種的保健品按照GB/T4789-2003食品衛生微生物學檢驗方法進行檢驗，發現不合格率已經達到了10%以上。檢驗結果顯示出我國保健食品安全存在很大的問題，檢測過程中統計檢測結果發現，主要存在菌數超標、致病菌檢測不合格的現象。由此可知對保健食品產品的方法驗證是十分必要的[10]。

4 總結

通過以上實驗，采用傳統方法對菌株在培養基中培養模擬保健食品的受微生物污染計數，可以得到以下結論：依據國家建議的保健食品衛生微生物檢驗方法，與采用培養基稀釋法來對保健食品受微生物污染的檢測存在很大差別，這就是說目前我國采用的國家標準存在缺陷，從保健食品的安全考慮，應該在食品生產最后階段添加一項確認保健食品衛生微生物檢驗方法的有效性工作，確保保健食品沒有受微生物污染，以此提高保健食品的質量級別。

[參考文獻]

[1] GBl6740-1997. 保健（功能）食品通用標準[S]. 1997.

[2] GB/T4789. I～4789.31～2003，食品衛生微生物學檢驗[S]. 2003.

[3] 中國藥典[S]. 一部，2005：附錄X.

[4] 劉如玉，陳守濤. 黃連等8種中藥對常引起醫院內感染的條件致病菌體外抗菌活性檢測[J]. 福建中醫學院學報，2004，14（2）：26-28.

[5] 蘇德模，馬緒榮. 藥品微生物檢驗技術[M]. 北京：華齡出版社，2007：3.

[6] 王翠蓉. 薄性康藥膜微生物限度檢查方法的建立和驗證[J]. 中國藥事，2008，22（1）：74-76.

[7] 肖海龍，錢楓，羅有福，等. 食品微生物檢驗方法間一致性評價及分析[J].中國衛生檢驗雜志，2009，（2）：58-60.

[8] 宋認，丁緒亮. 中藥大辭典[M]. 上下冊. 北京：人民衛生出版社，2001：334-336.

[9] 賀燕麗. 中國保?。üδ埽┦称返默F狀與發展[J]. 中國經貿導刊，2010， （15）：45-46.

[10] 房慧. 功能性食品及配料改善公眾營養健康[J]. 食品安全導刊，2009，9（1）：54-56.

（收稿日期：2012-10-15）