稻曲病病原菌毒素研究進展

摘要：水稻稻曲病是由稻曲病病原菌（Ustilaginoidea virens （Cooke）Tak.）引起的水稻穗部真菌病害。稻曲病病原菌次生代謝產生稻曲病病原菌毒素（Ustiloxins），該毒素是一類具有阻斷真核細胞有絲分裂活性的環肽毒素，有較強的細胞毒活性，對人畜和植物有毒害作用，也是一種具有潛在應用前景的抗腫瘤藥物。對稻曲病病原菌毒素的理化性質、毒性特點、獲取方式、檢測手段的研究進展進行了簡要綜述，并初步展望了稻曲病病原菌毒素的研究前景。

關鍵詞：稻曲病病原菌（Ustilaginoidea virens（Cooke）Tak.）；稻曲病病原菌毒素；提取和純化；檢測；人工合成

中圖分類號：S435.111.4+6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4701-04

Research Progress on Ustilaginoidea virens

FAN Yun-qing1，ZHANG Shu2a，YU Da-zhao2a，GONG Yan2b

（1.College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China；

2a.Hubei Key Laboratory of Crop Diseases， Insect Pests and Weeds Control； 2b.Institute of Agricultural Quality Standards Testing Technology， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract： Rice 1 smut is a common rice fungous disease caused by Ustilagionidea virens. As secondary metabolism of U. virens， ustiloxins are cyclopepetide mycotoxins， and exhibit phytotoxic and mycotoxic effects through their potent microtubule disassembly and inhibition of mitosis. Ustiloxins also pose potential applications as the antitumor agents. The chemistry， obtaining manners， isolation and purification， detection and artificial synthesis of ustiloxins were reviewed briefly， and the developing trends were also proposed.

Key words： Ustilaginoidea virens （Cooke）Tak.；ustiloxins； isolation and purification； detection； artificial synthesis

水稻稻曲病是一種世界性水稻真菌病害[1]，主要病癥為水稻穗部產生稻曲球。自20世紀70年代以來，由于水稻品種的變化、耕作制度的改變和化學肥料的大量使用，以及雜交水稻的問世等因素，稻曲病的發生及危害呈加重趨勢，已成為中國及世界上許多稻區的主要病害之一。1933～1937年，Yabuta等首先從稻曲球的乙醚提取物分離到一種色素，稱之為Ustilaginoidins。中國植物病理學家學家朱鳳美在20世紀50年代指出稻曲病含一類C9H6O7的有毒色素。鄧根生[2]經研究發現此毒素是一種生物堿。到現在為止，已經發現稻曲病病原菌（Ustilaginoidea virens （Cooke）Tak.）的次生代謝產物有兩類，第一類為綠核菌素（Ustilaginoidins），屬于萘并吡喃酮類，為脂溶性有色物質；另一類為稻曲病病原菌毒素（Ustiloxins），又稱黑粉菌素，屬于環肽類，為水溶性無色物質。學者們普遍認為稻曲病病原菌毒素是由稻曲病病原菌厚垣孢子產生的。這兩類次生代謝產物均具有較強的細胞毒活性。

稻曲病病原菌毒素一方面對植物和人畜產生毒性，與稻谷及其制品的食用安全有著密切的關系；另一方面可抑制癌細胞的有絲分裂，是一種具有潛在應用前景的抗腫瘤藥物。下面對稻曲病病原菌毒素的理化性質、毒性、獲取方式、檢測手段、人工合成以及研究展望等方面進行簡要綜述。

1 稻曲病病原菌毒素的理化性質

到目前為止，研究人員已從稻曲球中分離到6種毒素，分別是Ustiloxin A，Ustiloxin B，Ustiloxin C，Ustiloxin D，Ustiloxin E，Ustiloxin F，其結構式如圖1所示。因Ustiloxin E較為罕見，分離量太少而無法做試驗，目前其結構式和分子式尚不清楚[3]。稻曲病病原菌毒素最具代表性、含量最多的是Ustiloxin A，分子式為C28H43N5O12S，精確質量數為 673.262 9，為無色針晶、高極性和不揮發的化合物，茚三酮反應呈紫色，最大吸收波長為207、249和287 nm，在正離子模式下可生成加氫離子[M+H]+。

2 稻曲病病原菌毒素的毒害作用

2.1 對動物的毒害作用

稻曲病病原菌毒素對動物細胞有廣泛的生物活性。如Nakamura等[4]報道了其對老鼠的毒性主要是引起老鼠心臟、腎臟病變。高峻[5]報道，稻曲病粒對雞和兔有一定的毒性，混用病粒喂養的雞和兔都會出現慢性中毒癥狀，其心臟、肝臟和肺部發生病變，直至死亡。伍永炎[6]報道，患病動物會出現腹瀉、下痢、流涎、嘔吐、呼吸急促、中樞神經興奮或麻痹，頭部及四肢肌肉痙攣，渴感增加等癥狀。家畜體溫升高到40.5～41.5 ℃，腹痛磨牙、四肢刨地、拱背、肚腹卷縮、伏臥四肢伸直。病理解剖可見胃腸黏膜有出血性炎癥，肺部和脾臟出血，肝臟腫大，淋巴結充血水腫，心外膜及心內膜多有出血，胸腹腔有較多的透明黃色液體，泌尿系統有出血性炎癥，腦膜或腦皮質出血。

2.2 對植物的毒害作用

稻曲病病原菌毒素溶液對水稻種子萌發、幼苗生長及愈傷組織生長都具有毒害作用，且與品種田間的感病性和抗病性相一致[7]；稻曲病病原菌培養濾液稀釋40倍后對小麥胚根的生長有強烈的抑制作用，其對小麥胚根的抑制作用明顯高于對胚芽的抑制作用[8]；將稻曲病病原菌毒素稀釋100倍后對水稻種子萌發仍有強烈的抑制作用[9]；稻曲球水浸提液對玉米胚芽和胚根的生長也具有明顯的抑制作用[10]。

2.3 細胞毒活性

Koiso等[11]用Ustiloxin A和Ustiloxin B對人的胃、肺、心臟、結腸和腎的癌細胞系進行侵染試驗，發現其對各種癌細胞系都有抑制作用。后續研究發現Ustiloxin A和Ustiloxin B對癌細胞的作用與5-氟尿嘧啶相同。Ustiloxin A對胃癌（MKN-1）和乳癌（MCF-7）細胞的IC50分別為2.460和0.656 μg/mL。Ustiloxin B對胃癌MKN-1、MKN-7、MKN-74、肺癌RERF-LC-MA、乳癌MCF-7、腸癌WiDr、SW480和胃癌KU2株呈細胞毒活性，其IC50依次為3.22、4.91、5.19、5.60、0.86、4.68、6.08和4.43 μmol/L[12]。Morisaki等[13]測得的Ustiloxin A、Ustiloxin B、Ustiloxin C、Ustiloxin D、Ustiloxin F對微管蛋白組裝的中等有效抑制濃度分別為1.0、1.8、4.4、2.5、10.3 μmol/L。稻曲病病原菌毒素通過抑制真核生物微管蛋白的組裝與細胞骨架形成，從而起到抑制細胞有絲分裂的作用，其活性部位是稻曲病病原菌毒素的CH、NH官能團、酚羥基、C2和C6位烷基以及甘氨酸殘基的羧酸基團[13-15]。

2.4 白色菌株的毒性

王疏等[16]分離獲得1株不同于普通稻曲病病原菌的白化菌株。白元俊等[17]對普通菌株和白化菌株的產毒能力進行了比較研究，發現兩種菌株均能產生抑制水稻種子萌發和胚根、胚芽生長的毒素。白色菌株的產毒能力強于普通菌株，在相同濃度下白色菌株毒素的毒性明顯高于普通菌株。

3 稻曲病病原菌毒素的獲得

3.1 從病原體中獲得

3.1.1 稻曲病病原菌的分離 稻曲球營養豐富，易與雜菌共生，加之該菌生長緩慢，分離難度大。目前，稻曲病病原菌的分離主要有4種方法：即組織塊分離法[18]、菌核分離法[19]、稻曲球分離法[20]和厚垣孢子懸浮液法[21]。其中組織塊分離法成功率較高，是常用的分離方法。

3.1.2 產孢最適條件 程明淵等[22]在對比了不同培養基、不同營養條件（碳源和氮源）、不同 pH、不同溫度和光照及不同代數的菌株產孢能力后，初步明確PSA及大米培養基是較為適宜的產孢培養基；2～3代菌株最易產孢；NH4Cl和KNO3對厚垣孢子產生有一定的促進作用；產孢的適宜溫度為15～25 ℃；培養基適宜的pH是5～7，pH 6為最佳；光照對厚垣孢子的產生數量及時間都有很大的影響，明暗交替是較為適宜的培養條件。周永力等[18]研究發現，稻曲病病原菌在PSA、PDA兩種液體培養基和燕麥片液體培養基中以燕麥片最利于厚垣孢子的產生。王疏等[9]的研究表明，菌株差異性對于產孢有根本性的影響。

本課題組在前人研究的基礎上對稻曲病病原菌產孢最適條件進行了初步探索，并首次選取濕度作為條件之一進行了試驗。稻曲病病原菌產孢最適條件與程明淵等[22]報道的結果基本一致，相對濕度80%為最佳濕度條件。

3.1.3 毒素粗提取 以室內培養的稻曲病病原菌菌絲為原材料，毒素提取方法可按照葉建仁等[23]的甲醇提取法和陳美軍等[8]的硫酸銨沉淀法進行。其原材料采用的均是培養20 d的菌絲，用紗布濾去菌絲得到培養濾液；毒素粗提取不同在于前者取培養濾液100 mL，60 ℃水浴蒸干水分，加入100 mL甲醇，振蕩2 h，充分萃取后離心去除甲醇不溶物，上清液于60 ℃水浴鍋中水浴蒸干水分，再加入100 mL去離子水懸浮溶解，得到粗毒素液；后者取濾液100 mL，加入43.6 g固體硫酸銨溶解，用25%濃氨水調節pH至6.5，靜置過夜后離心（6 000 r/min）10 min，上清液即為稻曲病病原菌毒素粗提取液。

以稻曲球為原材料提取粗毒素的方法可按照王疏等[9]的索氏提取方法進行。稱取100 g干燥的稻曲球，研碎后裝入索氏提取器中，加入的甲醇-水（9∶1，V/V）回流10 h左右，得到墨綠色溶液，加活性碳脫色，離心（4 000 r/min）10 min得到淡黃色上清液，將上清液在30 ℃水浴鍋中水浴 1～2 d。最后得到淡黃色黏稠狀物，即為稻曲病病原菌粗毒素。也可參照Miyazaki等[24]的方法，稱取24 g稻曲球，加入240 mL水浸提，取45 mL上清液經過甲醇和水活化的C18固相萃取柱（10 g/35cc，美國Waters公司），用100 mL水洗柱，最后用100 mL 20%的甲醇溶液洗脫，洗脫液即為稻曲病病原菌粗提物。

3.1.4 稻曲病病原菌毒素的分離純化 稻曲病病原菌毒素的分離純化參照Koiso等[3]的方法進行：取稻曲球的去離子水浸提液，或取稻曲病病原菌培養液濾液，用反相硅膠層析柱進行粗分，再反復進行反相硅膠和大孔吸附樹脂（Diaion CHP 20P）柱層析，可分別獲得Ustiloxin A、B、C、D和F。

本實驗室采取硅膠薄層色譜純化稻曲病病原菌毒素，具體方法如下：取稻曲球，用水在室溫下浸泡1 h，濃縮，用ODS-SS-1020T（200 g，Senshu Scientific Co，Ltd，Tokyo，Japan）色譜柱和20%的甲醇分離純化，此時50 g稻曲球可得到377 mg淺黃褐色粉末（U-3）。U-3在硅膠薄層色譜TLC，用正丁醇∶甲醇∶水（3∶1∶1，V/V/V）為展開劑，分離Ustiloxin A。

這兩種方法對Ustiloxin A的收益均是500 g稻曲球獲得約10 mg純品。

3.2 稻曲病病原菌毒素的人工合成

在6種稻曲病病原菌毒素中，Ustiloxin D的人工合成技術最為完善。據Cao等[25]的報道，Ustiloxin D的人工合成由現成的D-絲氨酸和芳基氟材料來完成，為了構造稻曲病病原菌毒素特殊的手性烷基芳基醚支鏈，主反應中會涉及一個芳香族親核被取代；通過Sharpless不對稱氨基酸羥化反應來實現β-羥基酪氨酸基團的形成，以及酪氨酸基團和內酯基團的特定選擇性甲基化。

Ustiloxin A和B的人工合成技術也有進展，早在1997年，Hutton等[26]報道了合成具有立體選擇性的Ustiloxin A和B中間體（2S，4S，6S）-4-氫氧化物-5-苯亞磺酰戊氨酸的方法。以鈦作為催化劑，將N-Boc-（S）-丙烯基甘氨酸進行立體選擇性的溴代內酯化，之后與硫苯酚反應將溴元素置換為硫。這種具有高度立體選擇性的硫化物氧化后成為亞砜類，再經過內酯開環以及除去Boc組分的操作即可得到中間體。2005年，Luke等[14]報道了利用埃文斯氏Salen-A1來催化巰基異香藍素衍生物的醇醛縮合反應，產物與戊氨酸組結合，再通過不對稱氧化反應形成亞砜類，從而為化學合成Ustiloxin A的多巴-亞磺酰戊氨酸結構開辟了道路。

Ustiloxins人工合成法的成熟有利于人們更深入地了解其對有絲分裂有強效抑制作用的天然物質，有利于其同系物和同型物的合成，以便大量使用。

4 稻曲病病原菌毒素的檢測

在稻曲病病原菌毒素粗提液中以Ustiloxin A含量最高，約為80%，因此稻曲病病原菌毒素的檢測分析主要針對的是Ustiloxin A，可采用免疫測定的方法檢測。因Ustiloxin A分子量較小，不能直接用作效價檢測的抗原，須將Ustiloxin A與載體蛋白如卵清蛋白（OA）偶聯后才能作檢測抗血清效價的抗原。經ELISA測定效價表明，用戊二醛作為偶聯劑較好，且該抗血清效價已達到了免疫學檢測的基本要求。為了研究抗體的特異性，陳美軍等[8]做了進一步的免疫膠體金標記分析，結果表明所制備的抗體能與毒素特異性結合。

儀器檢測可采用Miyazaki等[24]的高效液相色譜法，HPLC條件為：Wakosil-II 5C18 RS柱，流動相為水-甲醇-磷酸（400∶100∶1，V/V/V），流速為0.5 mL/min，二極管陣列檢測器，紫外檢測波長為254 nm。本課題組另摸索出超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜方法，UPLC條件為：Waters UPLC BEH C18柱（ID 2.1 mm×100 mm）；流動相A為5 mmol/L甲酸銨/甲酸（pH 4.0），流動相B為甲醇，流動相配比是90%A和10%B，等度洗脫；流速0.25 mL/min，進樣體積為5 μL。該超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜方法檢測所需的時間（6.36 min）是Miyazaki等[24]所述的HPLC方法的50%左右。

5 研究展望

國內外對稻曲病病原菌毒素的研究處于初步階段，多集中在對動植物毒性、化學合成、檢測分析等方面，還存在很多問題值得進一步探討，如稻曲病病原菌毒素的產生機理；稻曲病病原菌的生長與毒素產生、釋放之間的關系問題；稻曲病病原菌毒素的降解機理；稻曲病病原菌毒素進入機體的動力學機制；稻曲病病原菌毒素快速檢測技術研究，稻曲病病原菌毒素引起的食品安全風險預警及評估等。

目前已證實Ustiloxin A和B是強有力的抗有絲分裂劑，對人體乳腺癌和肺癌細胞的抑制非常有效。如何將其變害為寶，化害為利，也將成為稻曲病病原菌毒素的另一個重要的研究方向。

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（責任編輯 昌炎新）

收稿日期：2012-02-17

基金項目：農作物重大病蟲草害防控湖北省重點實驗室開放課題（2011CDIWC-1-1）；湖北省自然科學基金項目（2011CDB117）；湖北省農業

科學院青年基金項目（2011NKYJJ21）；湖北省農業科技創新中心資助項目（2012-620-000-002）

作者簡介：范允卿（1988-），男，河南新鄉人，在讀碩士研究生，研究方向為食品安全分析，（電話）13419535398（電子信箱）925567540@qq.com；

通訊作者，龔 艷，助理研究員，博士，主要從事農業環境分析和農產品質量安全研究工作，（電子信箱）gongyan1026@qq.com。