高粱ＳＳＲ標記的篩選及ＰＣＲ反應程序的優化

摘要：以ＢＪ－２９９、Ｔｘ６２２Ｂ、Ｗ４５６、忻粱５２和Ｒｏｍａ ５個高粱［Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．） Ｍｏｅｎｃｈ］品種的基因組ＤＮＡ為模板進行ＰＣＲ擴增以篩選ＳＳＲ分子標記引物。設計不同的退火溫度和擴增程序，對２５０對ＳＳＲ引物進行篩選和反應程序的優化。結果表明，２５０對ＳＳＲ引物中有２２３對引物擴增成功，大部分引物的退火溫度為５５～５７ ℃，共篩選出１２５對在耐鹽堿品種ＢＪ－２９９與鹽堿敏感品種Ｔｘ６２２Ｂ間表現出多態性的ＳＳＲ引物。

關鍵詞：高粱［Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．） Ｍｏｅｎｃｈ］；ＳＳＲ；ＰＣＲ；引物篩選

中圖分類號：Ｓ５１４；Ｑ９４３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）17－3869-03

The Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ of ＳＳＲ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ

ＨＡＮ Ｙｕｎ，ＧＡＯ Ｊｉａｎ－ｍｉｎｇ，ＳＵＮ Ｓｈｏｕ－ｊｕｎ，ＰＥＩ Ｚｈｏｎｇ－ｙｏｕ，ＬＵＯ Ｆｅｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３００３８４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ５ Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ， ＢＪ－２９９， Ｔｘ６２２Ｂ， Ｗ４５６， Ｘｉｎｌｉａｎｇ ５２ ａｎｄ Ｒｏｍａ， ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｂｙ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ， ２２３ ｏｕｔ ｏｆ ２５０ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ was ｍｏｓｔｌｙ ５５～５７ ℃． １２５ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｓｈｏｗｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓａｌｉｎｅ ａｌｋａｌｉ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｖａｒｉｅｔｙ ＢＪ－２９９ ａｎｄ ｓａｌｉｎｅ ａｌｋａｌｉ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖａｒｉｅｔｙ Ｔｘ６２２Ｂ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．） Ｍｏｅｎｃｈ； ＳＳＲ； ＰＣＲ； ｐｒｉｍｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ

近年來，分子標記技術已被廣泛應用于動植物基因組和遺傳育種等的研究，成為現代分子生物學和遺傳學發展的主流［１］。其中ＳＳＲ標記技術具有易于操作、技術簡便、重復性和穩定性好等特點，目前在玉米、水稻、大豆和小麥等作物的遺傳連鎖圖譜構建［２－５］、品種鑒定［６］、種子純度檢測［７］、基因定位［８－１１］、遺傳差異和多樣性研究［１２－１６］等方面得到了廣泛應用。高粱［Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．） Ｍｏｅｎｃｈ］是世界上第五大禾谷類作物［１７］，可作為糧食作物及動物飼料。ＳＳＲ分子標記在高粱的遺傳育種等研究中已有廣泛的應用［１８，１９］。Ｌｉ等［２０］已經在高粱１０條染色體上物理定位了１ ６９２個ＳＳＲ標記；Ｍｅｎｚ等［２１］通過物理定位和遺傳定位在高粱的１０條染色體上定位了２０２個ＳＳＲ標記，這些ＳＳＲ標記為高粱的遺傳改良研究奠定了基礎。然而這些已報道的ＳＳＲ的ＰＣＲ反應條件不一樣，因此有必要建立高效通用的ＳＳＲ反應體系，以提高分析效率。本研究對高粱ＳＳＲ－ＰＣＲ反應條件進行優化并進行了ＳＳＲ引物的篩選，以期為高粱種質資源遺傳結構分析和重要農藝性狀的ＱＴＬ定位奠定基礎。

１ 材料與方法

１．１ 材料

實驗選用３個甜高粱品種Ｗ４５６、Ｒｏｍａ和ＢＪ－２９９（耐鹽堿品種）、１個粒用高粱品種忻粱５２及１個保持系Ｔｘ６２２Ｂ（鹽堿敏感品種），均由天津農學院作物遺傳育種重點實驗室提供。２００９年將這些高粱種植于天津農學院實驗田，在植株拔節期前后取各單株葉片，液氮速凍后保存于－８０ ℃超低溫冰箱中備用。

１．２ 實驗方法

１．２．１ 基因組ＤＮＡ的提取 采用改良的ＣＴＡＢ法從高粱葉片中提取基因組ＤＮＡ［２２］，使用０．８％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提ＤＮＡ的數量與質量，將濃度調整一致后于－２０ ℃貯存備用。

１．２．２ ＳＳＲ引物的選擇 采用Ｐｒｅｍｉｅｒ ５軟件對已報道的ＳＳＲ引物的退火溫度等參數進行計算，首先保留退火溫度為５５～６５ ℃、ＧＣ含量為４０％～６０％和目標片段長度不小于１２０ ｂｐ的引物，然后在保證遺傳距離比較均勻的前提下，選擇等位基因數目多、其他參數較優的引物，共挑選了２５０對引物用于本實驗，其染色體分布及平均物理距離列于表１。引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。ＰＣＲ反應體系為１５ μＬ，包括５ ｎｇ／μＬ的ＤＮＡ模板４ μＬ、５ Ｕ／μＬ Ｔａｑ酶 ０．１ μＬ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １．５ μＬ、０．７５ μｍｏｌ／Ｌ正反向引物各６ μＬ、１０ ｍｍｏｌ／μＬ ｄＮＴＰｓ ０．３ μＬ、超純水３．１ μＬ。

１．２．３ ＰＣＲ反應程序的優化 由于在進行ＳＳＲ－ＰＣＲ擴增時，退火溫度（Ｔｍ）和擴增程序對結果有較大影響，本研究的優化主要針對這兩個因素進行。退火溫度設５５、５７、５９、６１ ℃ ４個梯度，具體根據已報道的引物退火溫度進行設置?？偨Y已報道的ＰＣＲ反應條件，設計了２個反應程序：①９４ ℃預變性４ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，Ｔｍ退火３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５個循環；７２℃延伸６ ｍｉｎ。②９４ ℃預變性４ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，Ｔｍ退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５個循環；７２ ℃延伸６ ｍｉｎ。首先采用程序①，以ＢＪ－２９９和Ｔｘ６２２Ｂ的基因組ＤＮＡ為模板進行擴增，使用２．５％瓊脂糖凝膠電泳篩選出條帶清晰、穩定、單一、明亮的引物，結果不好的引物采用程序②擴增，如有需要再進行個別優化，并對該篩選出的最佳體系進行穩定性檢測。然后使用優化后的ＳＳＲ－ＰＣＲ反應程序，以５個高粱品種的基因組ＤＮＡ作為模板進行擴增，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。參照Ｂａｓｓａｍ等［２３］，采用６％變性聚丙烯酰胺變性凝膠電泳對耐鹽堿品種ＢＪ－２９９和鹽敏感品種Ｔｘ６２２Ｂ的擴增產物進行分離檢測，在愛普生凝膠掃描儀上進行掃描并保存圖像。

２ 結果與分析

２．１ ＳＳＲ－ＰＣＲ反應程序的建立

以ＢＪ－２９９和Ｔｘ６２２Ｂ的基因組ＤＮＡ為模板，采用程序①對２５０對引物進行擴增，擴增產物經２．５％瓊脂糖凝膠電泳，共篩選出２１８對引物，其擴增產物條帶清晰、穩定、單一、明亮（圖１），占總擴增引物的８７．２％。退火溫度在５５～５７ ℃時，大多數引物的擴增效果較好；當退火溫度超過６０ ℃時，大多數引物的擴增條帶明顯變弱。

采用程序②擴增程序①未擴增成功的３２對引物，結果有３對引物擴增出條帶清晰、穩定、單一的產物，占總引物的１．2％，且當退火溫度在５５～５７ ℃時，３對引物均可以得到較好的擴增效果（圖２）。對于程序①和程序②都沒有擴增成功的引物，采用提高模板濃度以及降低退火溫度等措施繼續優化，結果只有２對引物優化成功，其余引物則不再進行優化。通過優化反應條件共初步篩選出２２３對引物，占總引物數的８９．２％。

２．2 ＳＳＲ－ＰＣＲ反應體系的驗證及多態引物篩選

以５個品種的基因組ＤＮＡ為模板，對初篩得到的２２３對ＳＳＲ引物及優化后的ＰＣＲ擴增程序進行驗證，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物（圖３），同時用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測耐鹽堿品種ＢＪ－２９９和鹽敏感品種Ｔｘ６２２Ｂ的擴增產物（圖４）。結果表明，所有引物均產生了清晰的擴增條帶，且大多數引物無雜帶或拖帶現象，可見共有２２３對引物的ＰＣＲ反應體系優化成功。此外，瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，２２３對引物中有１２５對在耐鹽堿品種ＢＪ－２９９與鹽堿敏感品種Ｔｘ６２２Ｂ間表現多態性，多態率為５６．０５％，多態性引物在高粱染色體上的分布及平均物理距離見表１。

３ 小結與討論

本實驗通過優化ＰＣＲ反應的退火溫度和反應程序，獲得了２２３對能在５個高粱品種中穩定擴增的引物，還有２７對引物未能擴增成功，可能是反應體系、擴增程序還需進一步優化，也有可能是引物本身質量不高或引物序列合成錯誤，有待于進一步研究。

實驗初步篩選出的２２３對引物的在高粱染色體上的平均物理距離為２．９１ Ｍｂ，最大為３．１５ Ｍｂ，最小為２．６０ Ｍｂ。共發現１２５對引物在耐鹽堿品種ＢＪ－２９９與鹽堿敏感品種Ｔｘ６２２Ｂ間具有多態性，其平均物理距離為5．40 Ｍｂ，最大為９．３５ Ｍｂ，最小為３．３６ Ｍｂ。這些引物可作為該高粱群體耐鹽ＱＴＬ分析的ＳＳＲ標記［２４］，為開展分子標記輔助選擇高產耐鹽品系提供參考。

參考文獻：

［１］ ＰＯＥＨＬＭＡＮ Ｊ Ｍ． Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｓｏｒｇｈｕｍ ａｎｄ ｍｉｌｌｅｔ［Ａ］． ＰＯＥＨＬＭＡＮ Ｊ Ｍ． Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ［Ｍ］． Ames，Ｉｏｗａ：Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９4．５０８－５４１．

［２］ 李明瑩，鄒劍秋，徐秀明． 高粱ＳＳＲ分子標記反應體系的建立和優化［Ｊ］． 雜糧作物，２００７，２７（５）：３３１－３３５．

［３］ 鄭用璉，李建生，嚴建兵，等． 玉米Ｆ２群體分子標記偏分離的遺傳分析［Ｊ］． 遺傳學報，２００３，３０（１０）：９１３－９１８．

［４］ 張啟軍，葉少平，虞德容，等． 六張水稻遺傳連鎖圖譜的比較分析［Ｊ］． 西南農業學報，２００５，１８（５）：５８４－５９２．

［５］ ＨＡＹＤＥＮ Ｍ Ｊ， ＳＨＡＲＰ Ｐ Ｊ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ （ＳＳＲ） ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，２９（８）：ｅ４４．

［６］ ＳＩＬＢＥＲＳＴＥＩＮ Ｌ， ＫＯＶＡＬＳＫＩ Ｉ， ＢＲＯＴＭＡＮ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｔｒａｉｔｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］． Ｇｅｎｏｍｅ，２００３，４６（５）：７６１－７７３．

［７］ 許占友，邱麗娟，常汝鎮，等． 利用ＳＳＲ標記鑒定大豆種質［Ｊ］． 中國農業科學，１９９９，３２（Ｓ１）：４０－４８．

［８］ 武耀廷，張天真，郭旺珍，等． 陸地棉品種ＳＳＲ標記的多態性及用于雜交種純度檢測的研究［Ｊ］． 棉花學報，２００１，１３（３）：１３１－１３３．

［９］ ＬＩ Ｊ Z， ＨＥ Ｐ， ＺＨＥＮＧ Ｘ W，ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｘ ａｇｒｏｎｏｍｉｃ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ ｏｆ ｒｉｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｂｒｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ａｃｔａ Ｂｏｔａｎｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， １９９９， ４１（１１）：１１９９－１２０３．

［１０］ ＨＵ Ｙ K， ＸＩＮ Ｚ Y． ＲＡＰＤ ａｎｄ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ－Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｓｑｕａｒｒｏｓａ ａｍｐｈｉｄｉｐｌｏｉｄ Ｍ５３［Ｊ］． Ａｃｔａ Agronomics Ｓｉｎｉｃａ，２００１， ７（４）：４１５－４１９．

［１１］ 劉華清，吳為人，段遠霖，等． 水稻小穗特征基因ＦＺＰ的圖位克?。郏剩荩?遺傳學報，２００３，３０（９）：８１１－８１６．

［１２］ 嚴長杰，徐辰武，裔傳燈，等． 利用ＳＳＲ標記定位水稻糊化溫度的ＱＴＬｓ［Ｊ］． 遺傳學報， ２００１，２８（１１）：１００６－１０１１．

［１３］ 邱福林，莊杰云，華澤田，等． 北方雜交粳稻骨干親本遺傳差異的ＳＳＲ標記檢測［Ｊ］． 中國水稻科學，２００５，１９（２）：１０１－１０４．

［１４］ ＥＢＡＮＡ Ｋ， ＫＯＪＩＭＡ Ｙ， ＦＵＫＵＯＫＡ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｎｉ ｃｏｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｒｉｃｅ ｌａｎｄｒａｃｅ［Ｊ］． Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００８，５８（３）：２８１－２９１．

［１５］ ＭＣＣＯＵＣＨ Ｓ Ｒ， ＬＵ Ｈ， ＲＵＴＧＥＲ Ｊ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ １４５ ＵＳ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］． Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，４５（１）：６６－７６．

［１６］ 高睦槍，劉冬成，郭小麗，等． 我國部分冬小麥新品種（系）ＳＳＲ標記遺傳差異的研究［Ｊ］． 農業生物技術學報，２００１，９（１）：４９－５４．

［１７］ ＧＩＡＲＲＯＣＣＯ Ｌ Ｅ， ＭＡＲＡＳＳＩ Ｍ Ａ， ＳＡＬＥＲＮＯ Ｇ Ｌ． Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ａｒｇｅｎｔｉｎｅ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｗｉｔｈ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］． Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００７，４７（２）：８５３－８５８．

［１８］ ＫＯＮＧ Ｌ，ＤＯＮＧ Ｊ， ＨＡＲＴ Ｇ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ｌｉｎｋａｇｅ－ｍａｐ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ， ａｎｄ ａｌｌｅｌｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．） Ｍｏｅｎｃｈ ＤＮＡ ｓｉｍｐｌｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ（ＳＳＲｓ）［Ｊ］． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ， ２０００，１０１（３）：４３８－４４８．

［１９］ ＳＣＨＬＯＳＳ Ｓ Ｊ， ＭＩＴＣＨＥＬＬ Ｓ Ｅ， ＷＨＩＴＥ Ｇ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＦＬＰ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ＳＳＲ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．） Ｍｏｅｎｃｈ［Ｊ］． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ， ２００２，１０５（６）：９１２－９２０．

［２０］ ＬＩ Ｍ Ｌ，ＮＡＮＡ ＹＵＹＡＭＡ， ＬＥ ＬＵＯ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ １ ７５８ ｎｅｗ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｒｏｍ ｐｕｂｌｉｃ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｓｏｒｇｈｕｍ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００９，２４（１）：４１－４７．

［２１］ ＭＥＮＺ Ｍ，ＫＬＥＩＮ Ｒ，ＭＵＬＬＥＴ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ａ ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｏｆ Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．） Ｍｏｅｎｃｈ ｂａｓｅｄ ｏｎ ２ ９２６ ＡＦＬＰ， ＲＦＬＰ ａｎｄ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２， ４８（５－６）：４８３－４９９．

［２２］ ＤＯＹＬＥ Ｊ Ｊ，ＤＯＹＬＥ Ｊ Ｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｆｒｅｓｈ ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］． Ｆｏｃｕｓ，１９９０，１２（1）：１３－１５．

［２３］ ＢＡＳＳＡＭ Ｂ Ｊ， ＣＡＥＴＡＮＯ－ＡＮＯＬＬ?魪Ｓ Ｇ， ＧＲＥＳＳＨＯＦＦ Ｐ Ｍ． Ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ［Ｊ］． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，１９６（１）：８０－８３．

［２４］ 周延清． ＤＮＡ分子標記技術在植物研究中的應用［Ｍ］． 北京：化學工業出版社，２００５．４．