一株內生細菌EA19的分離鑒定及其對小麥白粉病菌的抑制效果

摘要：從藥用植物一年蓬莖組織中分離并篩選獲得了1株內生生防細菌EA19。經形態學、生理生化和16 S rRNA編碼基因序列分析等實驗，EA19與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）親緣關系最近。采用菌絲生長速率法對EA19進行了10種植物病原真菌的抑菌活性測定。結果表明，EA19菌體對稻梨孢、鐮孢菌、膠孢炭疽菌、稻平臍蠕孢、立枯絲核菌、核盤菌、鏈格孢和青霉菌等植物病原真菌具有拮抗活性，對稻梨孢和核盤菌的抑制率分別達到96.99%±1.10%和99.16%±0.65%。EA19菌體對小麥白粉病菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）的分生孢子萌發和吸器形成具有極顯著的抑制作用（P<0.01），并導致病菌附著胞發育畸形。

關鍵詞：內生細菌；解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；分離鑒定；小麥白粉病菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）

中圖分類號：S476.1；S435.121.4+6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5344-04

Isolation and Characterization of an Endophytic Bacterium EA19 with Antifungal Activity to Wheat Powdery Mildew Pathogen

ZENG Fan-song，XIANG Li-bo，YANG Li-jun，SHI Wen-qi，WANG Hua，GONG Shuang-jun，ZHANG Xue-jiang

（Institute of Plant Protection and Soil Science， Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory for Sustainable Control of Crop Diseases， Pest and Weeds in Hubei， Wuhan 430064，China）

Abstract： To screen antifungal bacteria for biological control of wheat powdery mildew， eleven bacterial isloates were isolated from stem of Erigeron annuus（L.） Pers， a medicinal plant species. Antifungal activity assay to 10 phytopathogens showed that EA19 exhibited strong inhibition activity against 8 phytopathogens including Magnaporthe grisea， Fusarium graminearum， Colletotrichum capsici， Bipolaris oryzae Breda de Haam， Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold， Rhizoctonia solani Kühn， Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary， Altermaria altemata （Fries） Keissler， S. rolfsii Sacc and Penicillium expansum （Link） Thom with broad spectrum， especially to M. grisea and S. sclerotiorum （Lib.） de Bary， with growth inhibition rate of 96.99%±1.10% and 99.16%±0.65%， respectively（P<0.01）. A histological investigation displayed that EA19 culture affected Blumeria graminis f.sp. tritici in vivo by inhibiting the germination of conidia and haustoria， and by increasing the rate of deformed appressorium in the early infection stage.

Key words： endophytic bactiria； Bacillus amyloliquefaciens； isolation and identification； Blumeria graminis f. sp. tritici

小麥白粉病是中國小麥產區普遍發生的重要病害之一。1989年，中國小麥白粉病發病面積超過670萬hm2，到1991年，發病面積擴展到1 200萬hm2[1]。近年來，由于小麥種植結構、耕作制度、水肥管理以及氣候條件等因素的改變，小麥白粉病的危害日趨復雜化。目前控制小麥白粉病主要依靠抗病品種和藥劑防治。由于小麥白粉病菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）生理小種群體結構經常發生變異，導致具有垂直抗性的品種在大面積種植3～5年后容易喪失抗性。藥劑防治是品種抗性被克服后的補救措施。三唑酮是目前生產上普遍施用的化學藥劑之一，但由于長時間、大面積的不合理施用，小麥白粉病菌已經對三唑酮產生了抗藥性[2]。從植物內生細菌資源中開發生物農藥是防治植物病害新的途徑之一，不僅能夠與化學藥劑配合施用以克服抗藥性，而且有望降低對環境的污染。

目前應用生防細菌來防治小麥白粉病已有很多報道。范瑛閣等[3]從土樣中分離并篩選獲得的3株細菌對小麥白粉病具有60%以上的防治效果，且具有增產作用。王美玲等[4]對白粉病生防細菌PE4進行發酵條件的探索。枯草芽孢桿菌A2發酵液防治小麥白粉病的最好效果可達72.22%[5]。植物內生細菌是防治植物病害的重要生防菌資源之一。它們不僅能與植物互惠共生，而且很多成員具有優良的抑菌活性。本研究旨在從植物組織中分離具有拮抗活性的內生細菌，為防治小麥白粉病等重要植物病害提供生防菌材料，并為進一步開發環境友好型生物農藥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

藥用植物一年蓬[Erigeron annuus（L.）Pers]從中國科學院武漢植物園藥用植物園采集獲得。

培養基：PSA固體培養基；NA培養基；LB培養基。

供試菌株：禾布氏白粉菌小麥專化型（Blumeria graminis f. sp. tritici）、稻梨孢（Magnaporthe grisea）、鐮孢菌（Fusarium graminearum）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum capsici）、稻平臍蠕孢（Bipolaris oryzae Breda de Haam）、大麗輪枝孢（Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）、核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary]、鏈格孢[Altermaria altemata （Fries）Keissler]、齊整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc）和青霉菌[Penicillium expansum（Link）Thom] 均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 細菌菌株的分離 將健康新鮮一年蓬的根、莖和葉分別用自來水沖洗干凈，切成1 cm2左右的小塊，在有效氯為5%的次氯酸鈉溶液中浸泡5 min， 再在70%的乙醇中浸泡30 s，無菌水漂洗4次，加1 mL無菌水細細研磨，將汁液稀釋至104、105和106倍，取200 μL涂布在NA平板上。30 ℃培養48 h，挑取單菌落多次劃線分離純化，于-70 ℃保存在50%的甘油中。同時將表面消毒過但未研磨的根、莖、葉組織塊放置在NA平板上作為陰性對照。

1.2.2 內生細菌的拮抗活性測定

1）對兼性腐生真菌的拮抗活性測定。從保存的菌種刮取少量菌液在NA平板上劃線，取單菌落在2 mL LB培養基中30 ℃，180 r/min搖培過夜，反復3次。以1∶100的比例吸取菌液在100 mL LB培養基中搖培18 h，取20 μL菌液均勻涂布在固體NA平板圓周外圍，30 ℃培養24 h制成拮抗平板，并以涂布LB培養基的平板為空白對照。將10種靶標菌（小麥白粉病菌除外）的新鮮菌餅（直徑為5 mm）放置在拮抗平板中央，28 ℃培養，直至對照平板菌落即將長滿全皿時，按下列公式計算抑制率：抑制率=（A-B）/（A-5）×100%，其中A、B分別表示對照菌落生長直徑和拮抗平板菌落生長直徑。

2）對專性寄生菌白粉病菌的生物活性測定及組織學觀察。EA19菌體的制備與兼營腐生菌的拮抗活性測定相同，組織學觀察參照Yang等[6]2008年報道的方法進行。

1.2.3 EA19的分類鑒定

1）形態學和生理生化鑒定。形態學觀察和革蘭氏染色參照周德慶[7]的方法進行。生理生化鑒定采用法國梅里埃公司VITEKK 2細菌鑒定儀（Ver：03.01）進行。

2）16 S rRNA編碼基因序列鑒定。采用CTAB法[8]提取基因組DNA，作為PCR反應的模板DNA。以16 S rRNA編碼基因通用引物[9]27bf （5′-AGAGT

TTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492br（5′- GGTTACC

TTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。反應條件為94 ℃ 3 min； 35循環包括94 ℃ ，1 min；60 ℃，30 s；72 ℃， 45 s； 72 ℃，10 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠回收后克隆到pMD18-T載體（大連寶生物科技有限公司） 并送北京鼎國生物有限公司進行序列測定。將序列在NCBI網站上進行BLAST （http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 比對，并采用鄰接法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

從藥用植物一年蓬的莖組織中分離獲得了11株細菌分離物。對10種兼性腐生植物病原真菌的拮抗活性測定結果表明，其中1株細菌分離物EA19對10種病原真菌均具有拮抗活性，平均抑制率分布在19.17%±4.57%～99.16%±0.65%之間。對稻梨孢、鐮孢菌、膠孢炭疽菌、稻平臍蠕孢、立枯絲核菌、核盤菌、鏈格孢和青霉菌的抑制率均超過62%，對稻梨孢和核盤菌的平均抑制率分別達到96.99%±1.10%和99.16%±0.65%（表1）。

2.2 EA19 的分類鑒定

2.2.1 菌體和菌落特征 亞甲基藍染色結果表明菌體呈短桿狀，能自由運動，可形成內生芽孢。在NA培養基上形成表面粗糙的圓形乳白色菌落。在LB和NA培養基上均不產生色素。革蘭氏染色呈陽性。

2.2.2 細菌的生理生化鑒定 VITEKK 2細菌鑒定結果（表2）表明，根據46項生理生化指標的測試結果，將EA19歸入枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）或解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.2.3 基于16 S rRNA編碼基因部分序列的鑒定 通過PCR擴增獲得了一條長度為1 511 bp的片段。序列測定后經BLAST比對并根據其他芽孢桿菌的16 S rRNA編碼基因序列構建系統發育樹（圖1），結果表明，EA19與解淀粉芽孢桿菌位于同一個分支中，表明EA19與解淀粉芽孢桿菌具有更近的親緣關系。

2.3 EA19菌體對小麥白粉病菌的抑制作用

采用臺盼藍染色觀察法，分別在接種小麥白粉病菌后8、24、48 h調查分生孢子萌發率，分別在接種后24、48、72 h調查附著胞、初生吸器、成熟吸器的形成率。結果表明，EA19對小麥白粉病菌分生孢子萌發率有極顯著的抑制作用（P<0.01），對病菌吸器形成率有極顯著的抑制作用（P<0.01）。EA19對已萌發孢子的附著胞形成率影響不顯著（P>0.05，圖2），但EA19處理后會導致小麥白粉病菌形成畸形的附著胞，并抑制吸器的形成（圖3）。

3 討論

植物內生細菌是開發天然活性化合物和生防菌的重要資源之一[10]。本研究從藥用植物一年蓬莖組織中分離獲得了1株內生細菌EA19。殺菌譜測定結果表明EA19菌體對稻瘟病菌等多種植物病原真菌的菌絲生長具有顯著抑制作用。對專性寄生菌小麥白粉病菌具有顯著的拮抗作用，能抑制分生孢子萌發和吸器形成。田間小區防治試驗結果表明，EA19發酵液和菌體對小麥赤霉病均具有70%以上的平均防效。EA19是針對多種植物病害具有開發潛力的生防菌株之一。

通過采用形態學、生理生化和分子生物學等手段進行鑒定，發現EA19在分類學上與解淀粉芽孢桿菌親緣關系最近。芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌可產生Surfactin、Iturin和Fengycin等脂肽類抗生素，具有廣譜抗菌活性[11]。通過針對抗菌化合物的特異性PCR擴增和高效液相色譜及質譜分析，EA19通過產生Iturin D類抗生素對病原真菌產生抑制作用。

為了進一步研究EA19對小麥白粉病的防治效果以及EA19菌體和發酵液對小麥白粉病的治療和鏟除作用，在今后的研究中應采用小麥盆栽試驗和田間小區試驗等相關試驗，完善活性化合物的系統鑒定、發酵條件的探索、菌體在小麥組織中的定殖，以進一步分析其對小麥產量及品質的影響等。

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（責任編輯 昌炎新）