新城疫病毒TS09耐熱株在BHK細胞上的傳代培養

摘要：以新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）TS09耐熱株為研究對象，研究了該毒株在幼倉鼠腎傳代細胞（BHK細胞）上的培養適應性。通過培養條件的優化、連續傳代培養和極限稀釋法純化，獲得了一株新的、純化的、適應BHK細胞的NDV耐熱株，命名為TS09-C株。TS09-C株的生物學特性測定結果表明，TS09-C株在BHK細胞中的增殖滴度為107.9 TCID50/mL，平均雞胚致死時間（MDT）大于120 h，腦內致病指數（ICPI）為0。與親本株TS09株相比，TS09-C株的基因序列發生了較為明顯的改變，但TS09-C株與親本株仍保持著較近的遺傳進化關系。

關鍵詞：新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）；耐熱；BHK細胞；傳代

中圖分類號：S852.65+9.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5424-04

Serial Passages Culture of Newcastle Disease Virus Thermostable TS09 Strain in BHK Cells

WEN Guo-yuan1，SHANG Yu1，2，GUO Jing1，2，YANG Jun1，WANG Hong-lin1，LUO Qing-ping1，

ZHANG Rong-rong1，SHAO Hua-bin1

（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China；

2. College of Veterinary Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，China）

Abstract： The characterization study of Newcastle disease virus （NDV） thermostable TS09 strain following serial passages in BHK cells was carried out. After optimization of the culture conditions， serial passages in BHK cells and purification by End-point dilutions， a newly purified， BHK cell-adapted NDV thermostable strain was developed， named TS09-C strain. Results from the biological characterization tests showed that the titer of TS09-C strain in BHK cells was 107.9 TCID50/mL， MDT>120 h and ICPI was 0. It was demonstrated that there were a number of mutations in the genome of TS09-C strain， as compared with the TS09 strain. However， the close genetic relationships among the TS09-C and TS09 strains were observed.

Key words： Newcastle disease virus（NDV）； thermostable； BHK cells； serial passages

新城疫病毒 （Newcastle disease virus，NDV）為副粘病毒科（Paramyxoviridae）副粘病毒屬（Paramyxovirus）成員，是有囊膜的負鏈RNA病毒。由NDV引起的新城疫（Newcastle disease，ND）是一種嚴重危害養禽業的高度接觸性傳染病，死亡率為90%以上，被國際獸疫局認定為兩種A類禽病之一（另一種為禽流感）[1]。ND的防控以免疫預防為主，當前國際上生產和使用的ND疫苗有兩大類，即活疫苗和滅活疫苗，活疫苗又包括低毒力和中等毒力活疫苗[2]。中等毒力活疫苗免疫效果優良，抗體一致性好，但對雛雞、鴿和鵪鶉等有較強的毒副作用，此類疫苗免疫的禽肉不符合出口要求；滅活疫苗使用安全、免疫效果好，但需要肌肉注射，費工費時，免疫成本高，且影響禽肉品質，使其應用受到了一定的限制；低毒力活疫苗以其使用方便（可通過拌料、飲水、噴霧、滴鼻、點眼或注射等多種方式給苗）和毒副作用較小等優點在我國應用最為廣泛。但低毒力活疫苗耐熱性能較差和冷藏條件要求高，常因保存或使用不當而影響疫苗免疫效果，不利于在我國氣溫普遍較高的南方地區和冷藏條件較差的農村進行大面積推廣應用。因此，以V4株為代表的ND低毒力耐熱活疫苗在我國有著較為廣闊的應用前景[3，4]。

當前，包括耐熱株在內的ND疫苗生產主要是使用雞胚，而以普通雞胚生產疫苗就可能使疫苗在生產過程中污染一些可由雞胚垂直傳播的疫病病原，導致這些病原隨著疫苗的使用而廣泛傳播。使用異源傳代細胞制備ND疫苗可避免雞胚傳播其他疫病的風險，關于NDV在各種細胞中的增殖研究國內外均有報道[5-8]。研究表明，NDV可在雞胚尿囊液中復制并產生感染性的病毒粒子，NDV強毒株可在多種體外培養細胞中復制，但是弱毒株只能在含有胰蛋白酶的細胞中進行復制[9]。但迄今為止，關于NDV耐熱株在異源細胞中傳代培養的系統研究（包括毒株生物學特性的改變、基因序列的變異等）尚未見報道。

該研究在已經通過雞胚選育得到NDV TS09耐熱株，并在對HN基因進行測定分析的基礎上[10]，進一步開展了TS09株在幼倉鼠腎傳代細胞（BHK細胞）中的傳代培養研究。通過培養條件的優化、連續傳代培養及極限稀釋法純化，獲得了一株新的、純化的、適應BHK細胞的NDV耐熱株，并對該毒株的生物學特性和部分基因序列進行了研究。為今后以異源傳代細胞生產NDV耐熱疫苗奠定了理論基礎和實驗依據，同時也為NDV耐熱株反向遺傳操作系統的建立提供了合適的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 NDV毒株

NDV TS09株由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所對NDV V4株經雞胚耐熱選育、純化后獲得，為雞胚尿囊液，病毒含量為108.6 EID50/mL。

1.2 試劑與材料

BHK細胞由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所保存；9～11日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；細胞培養瓶、細胞培養板購自Costar公司；DMEM細胞營養液、胎牛血清和胰蛋白酶購自Hyclone公司；TPCK-胰酶（接種病毒用）購自Sigma公司；0.5%雞紅細胞按常規方法配制。RNA抽提試劑盒和DNA純化試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司；dNTPs、Taq酶、M-MLV反轉錄酶等購自北京全式金生物技術有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 細胞培養及病毒接種傳代培養

BHK細胞的傳代培養及NDV TS09株的細胞接種均參照文獻[2]的方法進行。

1.4 NDV TS09-C株的生物學特性測定

NDV TS09-C株的生物學特性測定，如平均雞胚致死時間（MDT）、腦內致病指數（ICPI）、血凝活性效價（HA）、半數細胞感染劑量（TCID50）和半數雞胚感染劑量（EID50）等，均參照文獻[11]的方法進行。

1.5 NDV TS09株和TS09-C株F、HN基因的擴增與測序

根據GenBank已發表的新城疫病毒HB92株（GenBank登錄號：AY225110）的F和HN基因序列，設計兩對引物，引物序列見表1。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，分別擴增全長的F和HN基因，基因大小分別為1 791 bp和2 002 bp。

病毒基因組RNA的提取參照試劑盒說明書進行，提取的RNA溶解于17 μL DEPC水，加入1 μL逆轉錄引物，75 ℃ 5 min后立即冰浴，然后加入逆轉錄反應液：5×RT Buffer 5 μL、dNTPs（10 mmol/L） 1 μL和M-MLV 1 μL。42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，-20 ℃保存。

PCR反應體系：10×Buffer 5 μL，MgCl2（25 mmol/L） 3 μL，dNTPs （10 mmol/L） 1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，Taq酶（5 U/μL） 1 μL，RT PCR產物5 μL，補去離子水至50 μL。反應條件：95 ℃變性5 min； 94 ℃變性30 s，55 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。將特異性陽性條帶用DNA純化試劑盒純化回收，送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。

1.6 NDV TS09-C株F、HN基因的序列分析

使用DNAStar中的MegAlign程序對核苷酸序列進行同源性分析。遺傳進化分析由MEGA 4.0軟件完成，采用鄰近歸并法（the Neighbour-joining method）進行構建，參數為：Kimura雙參數（the Kimura two-parameter model）模型和Bootstrap值為100[12]。

2 結果與分析

2.1 胰蛋白酶最適濃度的優化

在不添加胰蛋白酶的情況下，將NDV TS09株接種于BHK細胞，進行5次連續傳代，觀察細胞病變和測定HA效價。結果均未出現典型的細胞病變，也未檢測出HA活性。以含有不同濃度胰蛋白酶（0.05～20.00 μg/mL）的維持液分別對生長至致密單層的BHK細胞進行維持培養，觀察細胞狀態。胰蛋白酶濃度在高于0.50 μg/mL的情況下，細胞在24 h內即可發生明顯的病變和死亡。在低于0.50 μg/mL的情況下，細胞無典型的病變。因此，胰蛋白酶對BHK細胞的最大無毒濃度為0.20 μg/mL（表2）。

2.2 NDV TS09耐熱株在BHK細胞中的傳代培養

以含0.20 μg/mL胰蛋白酶的DMEM（不含血清）為接種液和細胞維持液，將NDV TS09株雞胚毒在BHK細胞中進行17次連續傳代，除第11、13和15代為極限稀釋法純化病毒外（稀釋度由出現CPE的最高稀釋度決定），其余均為稀釋接種。對傳代病毒進行了生物學特性測定，測定結果見表3。由表3可知，第2、3代病毒未檢測出HA活性，也無典型CPE出現，第4、5代逐漸出現典型CPE，且HA效價也上升至23，表明該階段為TS09株在BHK細胞中的適應期；在第6～10代過程中，病毒的HA效價穩定在25，且CPE較為明顯（圖1），表明該階段為TS09株在BHK細胞中的穩定期；在第11～17代中，經過3次極限稀釋法純化病毒后，病毒的HA效價穩定在26，且病毒滴度由第10代的106.8 TCID50/mL上升至108.0 TCID50/mL。因此，通過TS09株在BHK細胞中的17次連續傳代（包括3次極限稀釋法純化），獲得了一株新的、純化的新城疫病毒細胞適應株，命名為TS09-C株。與親本株相比，TS09-C株的細胞增殖滴度由103.3 TCID50/mL上升至107.9 TCID50/mL，表明TS09-C株為BHK細胞適應株。此外，MDT和ICPI測定結果表明，TS09-C株保持了親本株的低毒性。

2.3 NDV TS09-C株F和HN基因的序列測定與分析

采用設計的引物對TS09-C株和TS09株的F、HN基因進行PCR擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見F和HN基因的特異條帶，與預期大小結果一致。將純化后的PCR產物送至測序公司進行序列測定，獲得了TS09-C株和TS09株的F、HN基因序列。

對TS09-C株和TS09株的F基因、HN基因序列進行比較分析，由結果（表4）可知，TS09-C與TS09株的F基因、HN基因核苷酸同源性分別為99.7%和93.0%，氨基酸同源性分別為99.5%和96.5%，F蛋白裂解位點（第112-117位）的氨基酸序列有一處發生了突變，即G115R。由此可知TS09-C株與親本株相比發生了較大的基因變異，為新的、純化的新城疫病毒細胞適應株。

2.4 NDV毒株的遺傳進化分析

應用MEGA4.0軟件對包括TS09-C、TS09、V4株在內的16株NDV F基因進行遺傳進化分析，結果見圖2。由圖2可知，16個NDV毒株依據其親緣關系的遠近，可分為7個基因亞型，與文獻[12]報道一致。分析TS09-C株與TS09親本株及V4株的關系：TS09-C、TS09和V4株都位于基因Ⅰ型的單獨一個分支上，與HB92、I-2等毒株親緣關系較遠。結果表明TS09-C株仍屬于基因Ⅰ型。此結果與基于HN基因的遺傳進化分析結果基本一致。

3 小結與討論

將NDV耐熱株適應異源傳代細胞，建立耐熱株的細胞培養模型，可為今后以異源傳代細胞生產NDV耐熱活疫苗和建立NDV耐熱株的反向遺傳操作系統打下良好的工作基礎。但是，具有復雜基因背景的HB92株不適宜作為細胞適應性傳代的母本株。商雨等[10]重新對V4株進行雞胚耐熱選育，并以極限稀釋法進行純化，獲得了一株新的耐熱性和免疫原性優良的NDV毒株TS09株，并以TS09株為親本株開展了細胞適應性實驗。

關于NDV疫苗株在異源傳代細胞中傳代培養的研究報道較多。關平原等[5]證實NDV I系毒可以適應Vero細胞并能產生明顯的細胞病變。雖然其傳代培養物的HA效價較低（1∶10～1∶40），但其培養物的TCID50值較高（109.7/0.05 mL）。MDT、EID50測定結果表明，傳代毒與雞胚毒具有相同的毒價；古長慶等[13]研究表明，在含10 μg/mL胰蛋白酶時，在BHK細胞中傳代的V4株的毒力和HA效價都明顯提高（1∶512），能達到其在雞胚上的毒力和效價；Slosaris等[7]研究報道，經過9～10代的傳代培養，B1株可以適應BHK細胞，但其HA效價較低（1∶32），病毒滴度僅為2×106.0 PFU/mL。與雞胚毒相比，其毒力明顯上升，MDT由原來的90 h下降為42 h，ICPI由原來的0.21上升至0.60。因此，不同疫苗株在異源細胞傳代過程中的生物學特性變化情況并不一致。

在含有0.20 μg/mL胰蛋白酶的培養條件下，將TS09株在BHK細胞中連續進行了17次傳代（包括三次極限稀釋純化）。在經過第1～5代的適應階段、第6～10代的穩定階段和第11～15代的篩選純化階段后，獲得了一株純化的、適應BHK細胞的耐熱毒株，命名為TS09-C株。與親本株雞胚毒相比，TS09-C株細胞毒的HA效價明顯降低（1∶32），其EID50值由原有的108.6/mL下降至105.7/mL，但TCID50值由原有的103.3/mL上升至107.9/mL，充分表明新選育的TS09-C株為細胞適應毒。

通過對TS09-C株和親本株的F、HN基因進行序列測定與分析，發現兩毒株的F基因具有較高的核苷酸同源性（99.7%），但是TS09-C株在其F蛋白裂解位點處發生一氨基酸突變，即由112GKQGRL117突變為112GKQRRL117，此類突變在NDV中尚屬首次發現（經GenBank數據庫中的BLAST搜索驗證）；兩毒株HN基因的核苷酸同源性相對較低，為93.0%。結合此前的生物學特性比較結果，無論是在基因序列方面，還是在生物學特性方面，TS09-C株已經發生明顯的改變。因此，TS09-C株為一株新的、純化的、適應BHK細胞的耐熱新城疫病毒。但是，TS09-C株仍與親本株、V4株保持著較近的遺傳進化關系。

綜上所述，通過培養條件的優化、連續傳代培養及極限稀釋法純化，獲得了一株新的、純化的、適應BHK細胞的NDV耐熱毒株，命名為TS09-C株。對該毒株的生物學特性和部分基因序列進行了研究，結果表明，與親本株相比，該毒株的生物學特性和基因序列已經發生了明顯的改變，但仍與親本株有較近的進化關系。該研究為今后以異源傳代細胞生產NDV耐熱疫苗奠定了理論基礎和實驗依據，同時也為NDV耐熱株反向遺傳操作系統的建立提供了合適的細胞模型。

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（責任編輯 屠 晶）