RNA干擾技術在農作物害蟲防治中的應用

摘 要：RNA干擾（RNAi）技術作為基因沉默的工具，已被廣泛應用于農作物害蟲防治研究。準確選擇靶基因、將dsRNA或siRNA導入昆蟲體內、siRNA在昆蟲體內的擴增和擴散是RNAi技術應用于農作物害蟲防治的基礎。應用RNAi技術能有效地保護農作物抵抗害蟲危害，在農作物遺傳改良進行精準抗蟲方面具有重大的應用前景。

關鍵詞：RNA干擾，農作物，害蟲防治

中圖分類號：S435 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2012）12-0016-04

Application of RNAi Technique in Pest Management for Crop

Guo Qiang， Fan ZhongXue*， Chu Dong， Li XiaoQing

（High-Tech Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial Key Laboratory

of Crop Genetic Improvement and Ecology and Physiology， Jinan 250100， China）

Abstract RNA interference （RNAi） technique as a tool for gene silencing has been widely used in agriculture for the management of insect pests. Accurately selecting target genes， transferring dsRNA or siRNA into insects and amplifying and spreading the siRNA within the insects are the base for the application of RNAi on pest management. The application of RNAi technique could effectively protect crops from insect pests， and it has better prospect in accurate management of agricultural pests.

Key words RNAi； Crop； Pest management

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA（dsRNA）介導的特異性基因表達沉默現象，是生物的一種古老并且進化上高度保守的基因表達調節機制。它在真核生物中參與抵抗病毒入侵、抑制轉座子活動、調控基因的表達[1]，具有重要生物學意義。RNAi技術作為基因沉默的工具，已被廣泛應用于基因功能研究、基因治療和病毒防治等方面，也為農作物害蟲防治提供了新的策略，已成為生物技術領域的一個熱點。1 RNAi技術應用于農作物害蟲防治的基礎

11 選擇靶基因

利用RNAi技術保護農作物抵抗害蟲的可行性已被證實，2007年發表在Nature Biotechnology中的兩篇文章表明利用RNAi技術可以防治害蟲[2，3]。這種方法成功的關鍵是：選擇一個合適的靶基因，并在農作物中表達足夠量的能被害蟲攝取的dsRNA/siRNA。盡管針對的農作物和害蟲都不同，但仔細選擇靶基因是共同的。

12 害蟲RNAi的導入方法

RNAi常用的導入方法有注射、飼喂、浸泡、組織培養、病毒感染、轉基因等，但在昆蟲中主要用注射、飼喂和浸泡法進行RNAi研究。

在絕大多數昆蟲RNAi研究中，首選的輸入方法是將體外合成的微量的dsRNA/siRNA顯微注射到昆蟲體腔內。目前已在鱗翅目的煙草天蛾（Manduca sexta）[4，5]、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）[6]和棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）[7]等昆蟲建立了通過注射dsRNA/siRNA誘導RNAi的體系。但是注射法具有以下缺點：注射壓力和傷口不可避免地影響到昆蟲，如損傷表皮激發了免疫反應；顯微注射是一項較難掌握的技術。個體較大的昆蟲在注射后，傷口易愈合，成活率較高，而個體很小的昆蟲，在注射難度加大的同時，成活率也相對較低。由于顯微注射的局限性，此法較難用于大規模分析。

通過喂食誘導RNAi在絕大多數情況下可能是最誘人的方法，這是因為操作簡單方便，容易實現，對昆蟲造成的危害性小，不影響其他基因的表達。通過飼喂表達dsRNA/siRNA的作物、人工飼料或菌株，使昆蟲連續攝入dsRNA/siRNA，可有效抑制靶基因的表達。

將果蠅（Drosophila melanogaster）胚胎浸泡于dsRNA溶液中，可以抑制基因表達，其效果與注射法相當，只是需要更高的dsRNA濃度[8]。將果蠅S2細胞浸泡于細胞循環基因CycE和ago的dsRNA溶液中可以有效抑制基因的表達，從而提高蛋白的合成[9]。浸泡法適用于那些容易從溶液中吸收dsRNA/siRNA的特殊昆蟲細胞組織和昆蟲特定發育階段，所以應用得較少。

13 siRNA的擴增

在果蠅中RNAi介導的基因敲除局限于給予dsRNA/siRNA的部位，并且沉默效應有時間限制。實際上與線蟲（Caenorhabditis elegans）相比，在果蠅中還未發現系統性的長時間的RNAi效應。在C elegans中系統性的RNAi效應是一個擴增和擴散沉默信號的多步驟進程。如果一個相似的系統存在于昆蟲中，它將會使我們能夠靶向所有從昆蟲中選擇的目標（不止腸特異性目標），而且不再需要持續給予高水平dsRNA/siRNA，并因此能夠避免許多與dsRNA/siRNA在昆蟲腸道不穩定的相關問題。

14 RNAi的擴散

昆蟲的系統性RNAi首先在鞘翅類昆蟲赤擬谷盜（Tribolium castaneum）（粉甲蟲，flour beetle）中被證實。在T castaneum中鑒定了一個果蠅感覺剛毛形成基因Tc-achaete-scute（Tc-ASH）的同源基因，在一個單獨的位點注射Tc-ASH dsRNA至幼蟲導致成熟昆蟲的表皮剛毛缺失[10]。同時在親代昆蟲T castaneum注射特異性的dsRNA靶向Distalless（腿發育基因）、maxillopedia（同源異型基因）和proboscipedia（一個編碼形成唇和上頜觸須時必需的同源異型蛋白的基因），卵孵化后發育的后代胚胎中產生RNAi效應[11]。這些研究證明了昆蟲的系統性RNAi并且RNAi可以由親代遺傳到子代。

2 RNAi技術在農作物害蟲防治中的應用

RNAi被廣泛用于研究基因的功能、基因敲除、治療腫瘤和病毒感染等疾病，也被用于昆蟲中研究RNAi的機制和功能、基因的表達和調節，例如果蠅（D melanogaster）[12]、赤擬谷盜（T castaneum）[10]、家蠶（Bombyx mori）[13]等昆蟲。Chen等（2008）[14]注射合成的dsRNA/siRNA到甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）的四齡幼蟲誘導幾丁質合成酶（chitin synthase gene A，CHSA）沉默，結果發現大多異常的幼蟲不能蛻皮，或進入下一期的幼蟲明顯小于正常大小，并且氣管上壁不能統一擴張，明顯提高了異常發生率，表明可以利用RNAi來控制害蟲。這些研究大多是通過注射的方法將dsRNA/siRNA導入昆蟲體內，然而，注射法不適宜用于田間的害蟲防治。

為了有效地控制害蟲，害蟲應該能夠自然地通過飼喂和消化獲得dsRNA/siRNA[15]。通過飼喂轉基因植物誘導RNAi防治害蟲已在鱗翅目和鞘翅目昆蟲中試驗成功[16，17]。Mao等（2007）[3]研究發現表達P450基因（CYP6AE14）和谷胱甘肽基因GST1 dsRNA的棉花對取食的棉鈴蟲（H armigera）幼蟲誘導了RNAi，阻礙了幼蟲的發育，這一技術為防治農作物害蟲提供了新的策略。Baum等（2007）[2]鑒定了玉米根螢葉甲（Diabrotica virgifera virgifera Leconte）290個生長發育相關基因，利用RNAi飼喂該蟲幼蟲的方法篩選出14個在低dsRNA濃度對昆蟲具有致害效應的基因。例如，表達V型ATP酶A基因dsRNA的轉基因玉米受到玉米根螢葉甲的損害與對照組相比明顯降低，在攝食24 h內快速下調內源性mRNA，誘導特異性RNAi反應；編碼V型ATP酶亞單位和β-微管蛋白的dsRNA能夠使昆蟲產生系統性基因沉默。這些研究表明，RNAi在農作物遺傳改良進行精準抗蟲方面具有重大的應用前景。在這些研究中至少有14種昆蟲通過飼喂誘導RNAi，表明dsRNA/siRNA作為食物成分能有效地沉默靶基因[15]。還有一種比直接喂食dsRNA/siRNA更好的喂食方法，就是將產生dsRNA/siRNA的轉基因植株作為昆蟲的食物[2，3]。這種方法的好處在于能夠給予持續和穩定的dsRNA/siRNA。

RNAi應用于農作物抗害蟲具有以下優點：（1）抗害蟲的高效性；（2）抗害蟲兼顧特異性與廣譜性，轉基因植物表達害蟲重要基因的dsRNA/siRNA，基于dsRNA/siRNA的特異性程度，可獲得對一種或幾種害蟲的抗性，而不影響其它昆蟲；（3）因為轉基因植物表達的是dsRNA和siRNA而不是蛋白質，所以易于在農作物中推廣。由于插入到植物基因組DNA上的外源基因的干擾序列部分的mRNA 轉錄后形成發夾結構并被植物體內的核酸內切酶（Dicer）識別降解，不會被進一步翻譯成蛋白質，所以避免了外源蛋白質在植株內的積累，具有較高的生物安全性。作為植物調節生長發育和保持遺傳穩定性的重要機制，植物內源的dsRNA和siRNA大量存在，因此表達了與植物自身無同源序列的dsRNA，不會對寄主植物產生不良的影響，也更容易被接受。

3 影響RNAi技術防治害蟲的主要因素

31 dsRNA片段的長度

片段的長度決定了dsRNA的攝取和RNAi的效率[18]。在這些飼喂試驗中大多數dsRNA片段的長度為300～520 bp。Saleh等（2006）[18]認為對S2細胞的dsRNA的長度最少為211 bp。

32 靶基因序列

dsRNA/siRNA的序列特異性可以通過細致的生物信息學途徑做到最優，目標基因的序列將決定昆蟲中可能的脫靶效應。

33 dsRNA/siRNA濃度

對于每一個靶基因和生物體來說，誘導沉默的理想濃度需要確定。但是，超過理想濃度并不能誘導更強的沉默效果[19，20]。

34 目標昆蟲的生活周期

雖然晚期能更易處理，但早期的沉默效果常會更好。例如，在R prolixus中，nitropin 2 dsRNA對4齡幼蟲沒有沉默效果，而對2齡幼蟲有42%的沉默效果[21]；同樣在草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）中，5齡幼蟲比成蟲誘導了更強的沉默效果[22]。

35 RNAi的持續時間

在A pisum中對水通道蛋白的沉默效應持續了5天，然后降低[20]；Turner等（2006）[23]認為在蘋果淺褐卷葉蛾（Epiphyas postvittana）中信息素結合蛋白dsRNA的瞬時效應可能與目標蛋白的周轉率有關[23]。

4 前景展望

針對害蟲的不同時期選擇合適的dsRNA/siRNA長度、序列、濃度，應用RNAi技術防治害蟲。目前只對少數幾種昆蟲進行了研究，實驗室內的成功能否轉為有效的田間害蟲控制，以及這種方法的長期影響等都需要進一步的研究和觀察。利用RNAi技術控制農作物害蟲無疑具有廣闊的應用前景，但目前還僅僅處于實驗室研究階段，相信這方面的研究突破一定會為未來的農作物害蟲控制提供新的途徑。參 考 文 獻：

[1] Baulcombe D RNA silencing in plants[J] Nature， 2004， 431：356-363

[2] Baum J A， Bogaert T， Clinton W， et al Control of coleopteran insect pests through RNA interference[J] Nat Biotechnol， 2007，25：1322-1326

[3] Mao Y B， Cai W J， Wang J W， et al Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol[J] Nat Biotechnol， 2007， 25： 1307-1313

[4] Levin D M， Breuer L N， Zhuang S， et al A hemocyte-specific integrin required for hemocytic encapsulation in the tobacco hornworm， Manduca sexta[J] Insect Biochem Mol Biol， 2005，35：369-380

[5] Soberón M， Pardo-López L， López I， et al Engineering modified Bt toxins to counter insect resistance[J] Science， 2007，318： 1640-1642

[6] Rajagopal R， Sivakumar S， Agrawal N， et al Silencing of midgut aminopeptidase N of spodoptera litura by double-stranded RNA establishes its role as Bacillus thuringiensis toxin receptor[J] J Biol Chem， 2002，277：46849-46851

[7] Swaminathan S， Rajagopal R， Venkatesh G R， et al Knockdown of aminopeptidase-N from helicoverpa armigera larvae and in transfected Sf21 cells by RNA interference reveals its functional interaction with Bacillus thuringiensis insecticidal protein[J] J Biol Chem， 2007，282（10）：7312-7319

[8] Eaton B A， Fetter R D， Davis G W Dynactin is necessary for synapse stabilization[J] Neuron.， 2002，34：729-741

[9] March J C， Bentley W E RNAi-based tuning of cell cycling in Drosophila S2 cells-effects on recombinant protein yield[J] Appl Microbiol Biotechnol，2007， 73：1128-1135

（上接第18頁）

[10] Tomoyasu Y， Denell R E Larval RNAi in Tribolium （Coleoptera） for analyzing adult development[J] Dev Genes Evol， 2004， 214： 575-578

[11] Bucher G， Scholten J， Klingler M Parental RNAi in Tribolium（Coleoptera） [J] Curr Biol， 2002，12：85-86

[12] Miller S C， Brown S J， Tomoyasu Y Larval RNAi in drosophila[J] Dev Genes Evol， 2008，218：505-510

[13] Ohnishi A， Hull J J， Matsumoto S Targeted disruption of genes in the Bombyx mori sex pheromone biosynthetic pathway[J] Proc Natl Acad Sci USA， 2006，103 （12）： 4398-4403

[14] Chen X， Tian H， Zou L， et al Disruption of Spodoptera exigua larval development by silencing chitin synthase gene A with RNA interference[J] Bull. Entomol Res，2008， 98 ： 613-619

[15] Huvenne H ， Smagghe G Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control： A review[J] J Insect Physiol， 2010， 56： 227-235

[16] Gordon K H， Waterhouse P M RNAi for insect-proof plants[J] Nat Biotechnol， 2007，25：1231-1232

[17] Price D R，Gatehouse J A RNAi-mediated crop protection against insects[J] Trends Biotechnol， 2008，26： 393-40

[18] Saleh M C， van Rij R P， Hekele A， et al The endocytic pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing[J] Nat Cell Biol， 2006， 8： 793-802

[19] Meyering-Vos M，Muller A RNA interference suggests sulfakinins as satiety effectors in the cricket gryllus bimaculatus[J] J Insect Physiol， 2007， 53：840-848

[20] Shakesby A J， Wallace I S， Pritchard H V，et al A water-specific aquaporin involved in aphid osmoregulation[J] Insect Biochem Mol Biol， 2009， 39： 1-10

[21] Araujoa R N， Santosa A， Pintoa F S， et al RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus （Hemiptera： Reduviidae） by dsRNA ingestion or injection[J] Insect Biochem Mol Biol， 2006， 36： 683-693

[22] Griebler M， Westerlund S A， Hoffmann K H， et al RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph[J] J Insect Physiol， 2008， 54：997-1007

[23] Turner C T， Davy M W， MacDiarmid R M， et al RNA interference in the light brown apple moth， Epiphyas postvittana （Walker） induced by double-stranded RNA feeding[J] Insect Mol Biol， 2006， 15： 383-391 山 東 農 業 科 學 2012，44（12）：24～27