根癌農桿菌介導的玉米自交系A188愈傷組織再生條件的優化

摘 要：以A188玉米自交系的愈傷組織為材料，研究了影響農桿菌介導玉米轉化和再生的各種因素，建立了該自交系的遺傳轉化體系。結果表明，10～15 mm的幼胚最易誘導出胚性愈傷組織；在侵染液和共培養基中加入乙酰丁香酮能顯著提高轉化效率；合適的菌液濃度（OD600=04）、共培養時間（3 d）、共培養溫度（24℃）有利于提高轉化效率。

關鍵詞：玉米；根癌農桿菌；愈傷組織；再生體系

中圖分類號：S513.01 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2012）12-0028-04

Optimization of Conditions for Agrobacterium tumefciens-Mediated

Transformation and Regeneration of Maize Inbred Line A188 Callus

Qiu PingPing1， Xin XiangQi2， Liu WenHao1， Su WenMin1， Zhu XiaoPing1*

（1.College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China；

2.Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China）

Abstract The factors affecting the Agrobacterium tumefciens-mediated transformation and regeneration of maize （Zea mays L.） embryogenic callus were optimized， and the genetic transformation system was established for the maize inbred line A188. The results indicated that 1.0～1.5 mm immature embryos were easier to induce embryogenic callus； the addition of acetosyringone in infection solution and common medium could increase the transformation efficiency significantly； appropriate bacterial concentration （OD600=0.4）， incubation time （3 days） and co-culture temperature （24℃） were benefit to increasing formation efficiency.

Key words Maize； Agrobacterium tumefciens； Callus； Regeneration system

農桿菌介導法以其操作簡單、低成本、轉基因拷貝數較低的優點在植物遺傳轉化研究中得到了廣泛應用，尤其是在雙子葉植物遺傳轉化中取得了顯著效果[1，2]。單子葉植物不是農桿菌的天然宿主，不易通過農桿菌進行遺傳轉化。但是一些研究表明農桿菌也可以轉化單子葉植物玉米，并初步建立了農桿菌介導的轉化體系[3，4]。

1975年，Green和Phillips利用玉米幼胚成功誘導出植株以來，利用玉米幼胚在不同培養基上誘導愈傷組織并再生出植株的成功研究頗多[5～7]，并證明幼胚是玉米誘導愈傷組織并再生植株的理想材料[8，9]。本試驗擬針對玉米自交系A188幼胚進行愈傷組織誘導和再生體系優化，以期建立高效表達的農桿菌介導的轉化體系。

1 材料與方法

11 材料

111 菌株和質粒 根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404和大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α均由本實驗室保存；帶有Bar選擇標記基因、Ubiquitin啟動子和PGIP目的基因（辣椒多聚半乳糖醛酸酶可逆性抑制蛋白）的雙元植物表達載體pCBUPGIP由本研究室構建。

112 植物材料及培養基 玉米自交系A188由本實驗室保存，玉米幼胚取自田間生長的玉米植株。

組培過程中的培養基除了生根培養基用MS作為基本培養基外，其他均使用N6培養基作為基本培養基。各培養基成分詳見表1。

12 方法

121 農桿菌培養 植物表達載體pCBUPGIP通過凍融法轉化入農桿菌菌株LBA4404中。攜帶目標載體的農桿菌菌株LBA4404在附加50 mg/L卡那霉素和100 mg/L利福平的YEP培養液中，28℃培養至OD600=800，然后4℃、4 000 r/min離心5 min，收集菌體，用N6基本液體培養基重懸，分別稀釋至OD600=02、03、04、05、06、08，加入100 mg/L的乙酰丁香酮，暫放28℃，緩慢搖動，用于侵染。

122 玉米愈傷組織的誘導 取玉米A188自交系授粉后10～15 d的幼穗，剝去苞葉，用70%酒精和01%升汞先后進行消毒。然后挑取大小分別為08～10、10～15、15～20 mm的幼胚，盾片向上接種于N6誘導培養基上，24℃暗培養。

123 受體材料的農桿菌轉化和再生 選取結構致密、顏色鮮亮、較松散的愈傷組織，用鑷子夾碎成2 mm大小的小塊，愈傷于上述準備好的菌液中浸泡20 min，期間不停地緩慢搖晃，然后棄去菌液，用滅菌濾紙吸干表面多余菌液，轉至N6共培養基上，20～28℃分別暗培養2、3、5、7、8 d。其后將愈傷組織用含400 mg/L羧芐青霉素的無菌水沖洗4～5次，每次10 min。將洗好的愈傷用滅菌濾紙吸干表面水分，轉至N6恢復培養基上，避光培養7 d。

將上述愈傷轉至N6選擇培養基上，暗培養15 d，10～15 d繼代1次，篩選繼代4～5次。將經過篩選的抗性愈傷組織轉至N6分化培養基上分化培養，25℃光/暗（16 h/8 h），誘導胚狀體形成和幼苗分化。然后進行生根培養，待長出健壯的根系移栽至溫室培養。

按照以下公式計算愈傷誘導率和轉化率：

愈傷誘導率（%）=（長出的愈傷組織塊數/接入的幼胚數）×100；

轉化率（%）=（愈傷組織出現綠芽塊數/侵染的愈傷組織塊數）×100。

轉化率以經過草丁膦（PPT）篩選后能存活的愈傷組織出現綠芽為基準，因為草丁膦對愈傷組織是正向篩選，沒有轉化成功的愈傷組織對草丁膦沒有抗性會逐漸死亡。

124 轉化株的PCR鑒定 取含PGIP基因的質粒為陽性對照，非轉化植株的DNA為陰性對照，進行PCR擴增鑒定。PGIP基因引物：

上游引物：ATGAAAAAAACTAATCGTGTTAC；

下游引物：TCATTTACATGGTGGCAAT。

2 結果與分析

21 幼胚大小對愈傷組織形成的影響

由圖1可以看出，當幼胚大小在08～10 mm之間時愈傷誘導率為42%，10～15 mm之間時，愈傷誘導率明顯提高，達到86%，15～20 mm之間時愈傷誘導率下降至63%。由此可見當幼胚大小在10～15 mm之間時，幼胚處于最佳萌發期，萌發活性最高，最易誘導產生胚性愈傷組織。

22 菌液濃度對玉米愈傷組織轉化率的影響

試驗結果（圖2）顯示，不同侵染液濃度對轉化率的影響差異顯著。侵染液OD600在01～04之間時，隨著農桿菌濃度的增加，A188愈傷組織轉化率從78%升高至113%；而當OD600大于04時，隨著農桿菌濃度的增加，愈傷組織轉化率逐漸下降。由此可以看出OD600=04時，玉米A188愈傷組織轉化率最高。

23 共培養時間對玉米愈傷組織轉化率的影響

用OD600=04的農桿菌LBA4404菌液侵染生長良好的愈傷組織，然后分別共培養2、3、5、7、8 d。如圖3所示，共培養3 d時，轉化率最高，達89%，隨著培養時間的延長，轉化率逐漸降低。共培養時間過短，T-DNA不能有效地向植物細胞轉移，所以轉化率不高；但是隨著共培養時間的延長，吸附在愈傷組織上的農桿菌增殖增加，使以后的抑菌難度增加，并且農桿菌對玉米愈傷組織的損傷增加，所以不能過度延長共培養時間。

24 共培養溫度對玉米愈傷組織轉化率的影響

玉米A188愈傷組織經農桿菌侵染后分別在20、22、24、26、28℃下共培養3 d，統計愈傷組織轉化率，結果如圖4。可以看出在24℃時愈傷組織轉化率最高，隨著溫度的升高轉化率逐漸降低。由此可知24℃是最佳共培養時間。

25 玉米A188遺傳轉化體系的建立

對再生體系的各條件優化后，經過組織培養成功得到轉基因玉米A188植株。圖5中，A為剛挑取培養2 d 的玉米A188幼胚；B為誘導2個月后篩選出的胚性愈傷組織，用來侵染；侵染后篩選出的愈傷組織經恢復培養逐漸成熟，C為恢復培養一周后的愈傷；D為愈傷組織進行分化培養2周后，愈傷組織逐漸綠化并開始分化綠色生長點，并進一步分化出小苗；E為分化出的小苗進行生根培養一個月后的健壯植株，準備移栽；F為轉化植株在無菌土中的長相。

農桿菌介導的玉米A188高效轉化再生體系：（1）取授粉后10～15 d的玉米幼穗，剝去苞葉挑取10～15 mm幼胚，盾片向上接種于N6誘導培養基上，24℃暗培養，10～14 d繼代1次，至產生Ⅱ型胚性愈傷組織。取繼代4～5次、結構致密、顏色鮮亮的Ⅱ型胚性愈傷組織作為農桿菌轉化的受體材料。

（2）農桿菌菌株LBA4404在附加50 mg/L Kanamycin和100 mg/L利福平的YEP培養液中，28℃培養至OD600=800，然后4℃、4 000 r/min離心5 min，收集菌體，用N6基本液體培養基重懸，稀釋至OD600=04，加入100 mg/L的乙酰丁香酮，暫放28℃，緩慢搖動，用于侵染。

（3）選取結構致密、顏色鮮亮、較松散的愈傷組織，用鑷子夾成2 mm大小的小塊，于上一步準備好的菌液中浸泡20 min，期間不停地緩慢搖晃，然后棄去菌液，用滅菌濾紙吸干表面多余菌液，轉至N6共培養基上，24℃暗培養3 d。

（4）3 d后將愈傷組織用含400 mg/L的羧芐青霉素的無菌水沖洗4～5次，每次10 min。將洗好愈傷用滅菌濾紙吸干表面水分，轉至N6恢復培養基上，避光培養7 d。

（5）將愈傷轉至N6選擇培養基上，暗培養15 d，10～15 d繼代1次，篩選繼代4～5次。

（6）將經過篩選的抗性愈傷組織轉至N6分化培養基上分化培養，25℃光/暗（16 h/8 h），誘導胚狀體形成和幼苗分化。然后進行生根培養，待長出健壯的根系移栽至溫室培養。

26 轉化植株PCR鑒定結果

提取再生植株葉片基因組DNA作為模板，利用PGIP基因引物進行PCR特異片段的擴增，得到約661 bp條帶，與陽性對照位置相同，和預期的PGIP基因的位置相一致；而陰性對照卻無任何條帶（圖6）。說明PCR陽性克隆的細胞中含有目的基因序列，可以初步確定為轉化株。

1～4：轉基因植株；5：陽性對照；6：陰性對照；

M：DL2000 Plus

3 結論與討論

大量研究證實愈傷組織可分為三類：Ⅰ型愈傷組織呈結構緊密的塊狀；Ⅱ型愈傷組織是比較理想的愈傷組織，結構良好，高度松散，顏色鮮亮，也稱其為胚性愈傷組織；Ⅲ型愈傷組織呈柔軟、松散、水浸狀，不具有分化植株的能力。Ⅱ型愈傷組織主要是通過胚胎發生途徑分化出植株，Ⅰ型愈傷組織則主要通過器官發生途徑分化出植株。玉米植株的再生主要受受體材料、基因型和培養條件的影響，本研究主要對受體材料和培養條件進行研究，并建立了高效表達的再生體系。

研究發現在農桿菌侵染愈傷組織時，在侵染液和共培養基中都加入乙酰丁香酮能顯著提高轉化效率，表明在增加農桿菌菌液和愈傷組織之間的親和性上起到了作用。在此基礎上還需在提高農桿菌對愈傷組織的侵染力、提高轉化率等方面作進一步的研究。參 考 文 獻：

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