土壤修復菌M—1固體發酵配方研究

摘 要： 固體發酵培養基配方篩選結果表明，腐殖酸（65%）+土（10%）+玉米粉（20%）+豆餅粉（5%）+生石灰（06%）較適合M-1菌株的生長繁殖，菌數達到14.9×108cfu/g，遠遠超出土壤肥料有效活菌數的行業標準。對該菌株培養條件進行正交試驗，結果表明，生石灰量04%、含水量40 ml、發酵時間6 d為菌株的最佳發酵條件，有效活菌數達到136×108cfu/g，是初始有效活菌數的近10倍。

關鍵詞：土壤修復；M-1；發酵配方

中圖分類號：S154.38+1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2012）12-0069-03

Study on Solid Fermentation Formula for Soil Remediation Bacteria M-1

Liu XiaoHui， Gao XiaoMei， Chen Shun， Wang HongQi， Huan MingHui

（Liaoning Institute of Microbiology， Chaoyang 122000， China）

Abstract The screening results showed that the formula of 65% humic acid+10% soil+20% corn powder+5% soybean powder+0.6% lime was better for the growth of M-1 strain， and the bacteria count reached 14×108 cfu/g， which was far beyond the industrial standards of effective viable counts in soil fertilizer. The orthogonal test of culture conditions was done， and the results showed that the optimum fermentation conditions were 0.4% lime， 40 ml water， fermenting for 6 days. Under this condition， the viable bacteria count achieved 136×108 cfu/g， which was nearly 10 times of the initial effective viable bacteria count.

Key words Soil remediation； M-1； Fermentation formula

土地利用率的提高和高度集約化經營加劇了連作障礙的發生，輕者造成減產減收，重者導致絕收，嚴重制約了設施農業的可持續發展。

針對引起連作障礙的主要構成因子，遼寧省微生物研究院篩選出具有抗病、促生功能和良好制劑生產性能的微生物菌株M-1。本試驗對其固體發酵培養基配方進行了優化，篩選出最佳發酵條件，為研制優良生防制劑及其產業化開發奠定了基礎。

1 材料與方法

11 試驗材料

111 原料 腐殖酸、豆餅粉、玉米面、麥麩、生石灰，均過20目篩子。

112 菌種保存培養基 高氏1號培養基：淀粉 200 g、KNO3 10 g、K2HPO4 05 g、MgSO4·7H2O 05 g、NaCl 05 g、FeSO4 001 g、瓊脂粉16 g，水1 000 ml，pH 72～74；01 MPa壓力下蒸汽滅菌20～30 min。

12 試驗方法

121 固體發酵培養基配方的確定 設6組處理（表1），利用腐殖酸為載體，每組100 g，分別裝入500 ml三角瓶中，調節水分，達到手握成松散團狀、不出水為準。121℃滅菌1 h后，取出。把備好的整支菌種斜面無菌操作，倒入無菌水18 ml攪勻，制成含孢子109 cfu/ml的菌懸液，將1 ml孢子菌懸液接到滅菌后的固體培養基中，置于29℃下培養5 d，每天搖動1～2次。陰干后過20目篩，梯度稀釋后用平板計數法測定有效菌數。

122 生石灰添加量對M-1菌株生長的影響 采用篩選的較優培養基配方，設定生石灰添加量為0、02%、04%、06%、08%、10%共5個梯度，通過調整配方中生石灰的含量，改變各處理的pH值，其它條件及操作同上。

123 含水量對M-1菌株生長的影響 調整配方中的含水量，設定30 、35、40、45 、50 ml共5個梯度，加生石灰量為02%，其他條件同上。

124 培養時間對M-1菌株生長的影響 在含水量40 ml的條件下，調整培養時間，設4、5、6、7、8 d共5個處理，其他條件同上。

125 加菌量對M-1菌株生長的影響 調整加菌量，將05、10、15、20、30 ml含孢子109 cfu/ml的菌懸液，接入固體培養基中，其它條件同上。

126 發酵條件的正交試驗 按菌株培養單因子試驗結果選擇石灰量、含水量和發酵時間3個因素，分別取3個水平，以L9（34）正交表進行正交試驗，重復2次，試驗因素和水平見表2。試驗結果用SPSS軟件處理，通過級差分析得出較優組合，通過方差分析篩選出關鍵因素，確定菌株的最佳發酵培養基條件。

2 結果與分析

21 不同培養基配方篩選結果

由表3可看出，固體發酵培養基配方4有效菌數最多，達到14.9×108cfu/g。以農業部微生物肥料質量監督檢驗測試中心的規定，顆粒劑型微生物菌肥有效活菌數為≥020×108cfu/g，本試驗最高菌數大大超出了該行業標準。因此選定配方4為最佳配方，進行下一步試驗。

22 加生石灰量對M-1菌株固體發酵的影響

由圖1可以看出，當生石灰加入量為02%時，固體培養基中有效活菌數可達到19×108 cfu/g。之后隨著生石灰加入量的增加，有效活菌數逐漸下降，說明該菌株適宜在微堿性的條件下生長。

圖1 生石灰量對固體發酵的影響

23 含水量對M-1菌株固體發酵的影響

由圖2可明顯看出，每100 g固體發酵料中最適含水量為40 ml，菌數可約達26×108cfu/g。當含水量超過40 ml時，有效活菌數急劇下降，說明含水量過高會抑制該菌株的生長繁殖。

圖2 含水量對固體發酵的影響

24 發酵時間對M-1菌株固體發酵的影響

由圖3可看出，該菌株的生長繁殖隨時間的延長而增加，當發酵時間達到7 d時，有效活菌數趨于平穩。因此，選定最佳發酵時間為7 d。

25 加菌量對M-1菌株固體發酵的影響

由圖4看出，當加菌量（含孢子數109 cfu/ml的菌懸液）增加到10 ml后，活菌數趨于平穩，說明10 ml該菌懸液可充分利用100 g發酵料，如加菌量過多沒有充足的營養而不能大量繁殖。故100 g發酵料中適宜加菌量為10 ml。

圖4 不同加菌量對固體發酵的影響

26 固體發酵條件的正交試驗結果

由極差分析結果（表4）可見，三因素的影響

程度依次為含水量>生石灰量>培養時間，較優組合為A3B2C1。因此確定加生石灰量04%、含水量40 ml、發酵時間6 d為菌株的最佳發酵條件。3 結論與討論

本試驗結果表明，配方4（腐殖酸65%+土10%+玉米面20%+豆餅粉5%+生石灰06%）較適合該菌株的生長繁殖，菌數達到14.9×108 cfu/g，遠遠超出了土壤肥料有效活菌數的行業標準。在以腐殖酸為固體發酵載體，不添加其他有機質的條件下，該菌株的有效活菌數較低；對該菌株培養條件進行正交試驗，結果表明，生石灰量04%、含水量40 ml、發酵時間6 d為菌株的最佳發酵條件，有效活菌數達到136×108cfu/g，是初始有效活菌數的近10倍。

固體發酵配方輔料中添加麥麩時菌株的有效活菌數明顯偏低，可推斷該菌株不能有效地利用麥麩作為生長基質；在添加自然土的培養基中有效活菌數明顯偏高，說明自然土中有適合菌株生長的營養成分，且該菌株能有效地利用該營養成分，與添加的其他輔料共同作用，促進自身的生長繁殖。參 考 文 獻：

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