一株蓖麻根際活性菌LX6的抑菌活性測定及其分子鑒定

摘 要：對蓖麻根際菌株LX6的抗菌活性進行了測定。結果表明，該菌株對多種植物病原真菌具有明顯的抑制作用，表現出廣譜抗菌活性。其中對三七根腐病菌（Cylindrocarpon destruans）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、玉米彎孢病菌（Curvularia lunata）和禾谷鐮刀病菌（Fusarium graminearum ）的抑菌效果均達50%以上。通過對LX6菌株的形態特征、染色反應、培養性狀、生理生化特征試驗以及16S rDNA鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌。

關鍵詞：蓖麻根際菌株LX6；抑菌活性；分子鑒定；枯草芽孢桿菌

中圖分類號：S154.38+1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2012）12-0078-03

Determination of Antibacterial Activity and Molecular Identification

of Antagonistic Bacterium LX6 from Castor-oil Rhizosphere

Chi YuCheng1*， Xu ManLin1*， Xie HongFeng1， Yang WeiQiang1， Wang BaoLiang2， Cao TieHua3

（1.Shandong Peanut Research Institute， Qingdao 266100， China；

2. Agricultural Bureau of Jiaonan City， Jiaonan 266400， China；

3.Jilin Academy of Agricultural Sciences， Changchun 130033， China）

Abstract The antagonistic activity of strain LX6 from castor-oil rhizosphere was determined in this paper. The results showed that LX6 strain had obvious antagonistic activity against many plant pathogenic fungus， especially to Cylindrocarpon destruans， Fusarium oxysporum， Curvularia Lunata and Fusarium graminearum， the antibacterial rate could be over 50%. According to the tests on morphological features， staining reaction， culture traits， physiological and biochemical characteristic and 16S rDNA， it was identified as Bacillus subtilis.

Key words Strain LX6 from castor-oil rhizospher； Antagonistic activity；Molecular identification； Bacillus subtilis

蓖麻種植在全世界30余個國家已經達到了工業化規模。在印度、中國、巴西、前蘇聯、泰國、埃塞俄比亞和菲律賓等國的蓖麻產量約占全世界蓖麻總產量的近88%。歷史上，巴西、中國、印度是主要的生產國。蓖麻提取物作為殺蟲劑已有廣泛的應用[1，2]，但對其根際微生物的研究還鮮有報道。

芽孢桿菌是生防細菌中表現較為突出的一種，被引入植物生物防治領域并表現出良好的發展趨勢，其以控制病害發生，促進植株生長，提高作物產量以及易于生產和運輸等方面表現出特有的優勢[3～6]。筆者從蓖麻根際土壤中篩選到一株對多種植物病原菌有良好抑制作用的生防細菌LX6，此菌株表現出了廣譜的抗菌活性。根據形態特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，鑒定其為枯草芽孢桿菌。

1 材料與方法

11 供試菌株及病原物

供試拮抗菌LX6和供試病原物（表1）均由本實驗室分離保存。

12 培養基

LB培養基（LB）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）分別用于LX6和真菌的固體培養，相應的培養液用于兩類微生物的液體培養，對峙培養法均在PDA培養基上進行。

13 試驗方法

131 平板對峙培養法測定對蓖麻枯萎病菌的抑制作用 采用平板對峙培養法[7]，在PDA平板中間接入培養3～4天的植物病原真菌，d=5 mm，28℃恒溫培養。1～2天后，挑取已經在28℃下培養3～4天的芽孢桿菌菌株菌體分別接種在距離真菌菌落中央2 cm處，使成為一個約d=2 mm的菌落，繼續培養，定期檢查抑制效果，測量菌落直徑，計算抑制率。

抑制率（%）=（對照真菌的生長直徑-拮抗菌作用后的真菌生長直徑）/對照真菌的生長直徑×100。

132 細菌鑒定方法 參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》對生防菌進行生理生化鑒定：將純化好的菌株接種到LB培養基上，28℃培養，24 h后取純化好的菌株涂片，進行革蘭氏染色及運動力檢測。生理生化測定包括氧化酶反應，VP試驗，淀粉水解，明膠液化，吲哚、葡萄糖的利用。

菌株16S rDNA鑒定：提取生防菌菌株的DNA，其提取方法主要參照TIANGEN TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒說明書進行；PCR擴增，參照TaKaRa公司的16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒說明書進行PCR擴增。擴增引物為細菌通用引物，序列如下：正向引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物 1541R：5′-AAGGAGGTGATCCACCC-3′。PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析特性，染色后置于3UVTMTransilluminator（UVP，USA）下，檢測擴增結果；16S rDNA序列測定與分析，所得擴增片段16S rDNA測序由金斯瑞（南京）有限公司進行序列測定。通過NCBI網站上的BLAST程序將測定的序列與GenBank中的序列比較，然后從GenBank中獲得和試驗菌株序列相近種、屬的16S rDNA序列。2 結果與分析

21 LX6對植物病原真菌的拮抗作用

表1結果顯示，生防菌株LX6對供試的12種病原菌都有不同程度的抑制作用，其中，對三七根腐病菌、棉花枯萎病菌、玉米彎孢病菌、禾谷鐮刀病菌均有較強的抑制效果（圖1），抑菌率均達50%以上。由此可見，LX6對植物真菌具有廣譜的抗菌效果。

首先提取生防細菌DNA，以該DNA為模板，16S rDNA通用引物為引物，對16S rDNA片段進行擴增。PCR產物電泳結果顯示，在分子量大小為 1 400 bp左右得到一條特異性好的條帶，與預期結果一致。擴增的片段進行序列測定，將測序的結果輸入NCBI網站上的BLAST程序進行比對，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）同源性最高，達到99%，初步鑒定為枯草芽孢桿菌，結合生理生化特性做進一步鑒定。

23 LX6菌株的生理生化測定

通過表面形態觀察，該菌為不規則形，白色，表面膜狀起皺，革蘭氏染色陽性，結合其他生理生化指標測定（表2），可以進一步判定菌株LX6為枯草芽孢桿菌。

3 結論與討論

芽孢桿菌是一類在土壤和植物根際廣泛存在的有益微生物，在植物病害的生防控制中顯現出了非常突出的應用價值，同時這類細菌具有良好的抗逆性， 對人畜無害， 不污染環境，且產芽孢易于生產和儲存，因而備受植病生防研究者的青睞。目前，已有多種菌株被商品化并廣泛用于鐮刀枯萎病、立枯病和曲霉病等多種植物病害的防治[8]。筆者從蓖麻根際篩選出一株生防菌LX6，經鑒定為枯草芽孢桿菌，對供試12種植物病原真菌均有較明顯的抑制作用，尤其對三七根腐病菌、棉花枯萎病菌、玉米彎孢病菌、禾谷鐮刀病菌有較強的抑制效果，抑菌率均達50%以上，顯現出其作為生防菌的顯著優勢和良好的應用前景。

枯草芽孢桿菌是一類能產生多種抗菌物質、具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力的桿狀細菌。目前已從不同來源的菌株中分離到多肽類、脂肽類、細菌素和蛋白質等多種類型的抗菌物質， 這些抗菌物質大多對病原真菌表現出強烈的拮抗活性[9～12]。本研究分離的一株枯草芽孢桿菌表現出突出的抗菌活性，值得深入研究其作用機理。在今后的工作中將嘗試著分離純化LX6的抑菌物質，以期為研究其作用機理、大量獲得抗菌物質打下基礎。另一方面也可借助分子生物學手段，根據GeneBank中公布的Bacillus subtilis的全序列，直接設計引物克隆抗菌蛋白基因并進行表達，以期大量獲得抗菌蛋白基因，并為下一步構建高效生防菌株打下基礎。參 考 文 獻：

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