RNA干擾與植物基因功能鑒定和分子育種

摘要：RNA干擾(RNA interference， RNAi)是一種應用siRNA (Small interfering RNA)或miRNA (MicroRNA)誘導目標mRNA降解的過程。該過程“干擾”了mRNA的正常穩定性，可使基因表達受到抑制。隨著RNAi技術的不斷發展，它已經廣泛應用于生物科學技術各個領域。本文在介紹RNAi的原理、植物RNAi的方法學特點、RNAi在植物基礎研究中的應用的基礎上，重點介紹了其在植物分子育種中的應用，涉及植物營養品質改良、植物抗性以及植物其它性狀改良的資源創新。

關鍵詞：基因功能 分子育種 植物 RNA干擾

RNA interference for plant gene functional identification and molecular breeding

CHEN Qian1，YAO Yong-Hong 2，CHAI You-Rong1*

(College of Agronomy and Biotechnology， Southwest University / Engineering Research Center of South Upland Agriculture， Ministry of Education， P. R. China; Chongqing， 400715; Chongqing Academy of Agricultural Sciences， Chongqing 401329)

Abstract：RNA interference (RNAi) refers to short double-stranded RNA-induced degradation of homologous mRNA. As a result， the gene expression can be inhibited. This process interferes the stability of mRNAs and inhibits the expression of this gene. As RNAi technology continues to develop， it has been widely used in various fields of biological science and technology. This paper first introduces the principles of RNAi， methodological features of plant RNAi and its application in plant basic studies， then introduced in detail of its application on plant molecular breeding for stock creation with improved nutrition quality， resistances and other related traits.

Key words：Gene function， molecular breeding， plants， RNA interference

RNA干擾(RNA interference， RNAi)是指將與靶基因的mRNA同源互補的雙鏈RNA (double-stranded RNA， dsRNA)導入細胞，能特異性地降解該mRNA，從而產生相應的功能表型缺失[1]。RNAi的生物學意義就在于它起到了監視和抑制異常的或外源的遺傳物質在細胞內的存在，維持本身遺傳物質的穩定性。RNAi在自然界中普遍存在，目前已在多種植物、渦蟲、果蠅、小鼠早期胚胎、線蟲等不同種屬的生物體中得到證實。而本文將重點介紹RNAi原理方法及其在植物遺傳改良中的應用和前景展望。RNAi實質上講是一種有效的基因敲除技術，被認為對植物遺傳改良起到重要作用。RNAi技術有助于人們更加深入地認識和了解植物生長發育的內在規律和分子基礎，調控植物有益性狀的高效表達，使有害基因處于抑制狀態，從而增強植物的抗御逆境及病毒侵染的分子機制，培育出高產、優質、高抗病性的新品種，從而達到分子育種目的。

1、RNAi的發生機制及其特點

RNAi主要依賴于RNA-RNA的相互作用，dsRNA也有可能與DNA相互作用而抑制基因的表達。如類病毒RNA序列的DNA拷貝被插入植物的基因組，當類病毒RNA開始復制時，它的DNA拷貝就會出現甲基化，這提示RNA序列有可能引起DNA序列的甲基化[2]。

RNAi的發生大致分為3個階段：(1) siRNA (small interfering RNA)形成階段：細胞中有內源或外源性dsRNA存在時，能夠被RNaseIII家族中一個能特異識別dsRNA的Dicer酶所識別，并以一種ATP依賴的方式逐步切割成21-25nt的小分子干擾RNA片段siRNA；(2) RNA誘導沉默復合物RISC (RNA-induced silencing complex)的形成階段：siRNA結合一個核酶復合物，形成RNA誘導沉默復合物RISC；(3)效應階段：結合了siRNA的RISC可以被ATP活化，將siRNA雙鏈解開，卸下正義RNA，反義RNA仍結合在復合物RISC上，并引導RISC通過堿基互補配對定位到同源mRNA轉錄本上，在核酸內切酶的作用下開始降解mRNA，從而阻斷了其翻譯成蛋白質，表現為基因沉默[3-4]。siRNA是RNAi的中間效應分子，RNAi過程中具有自身循環放大效應，而且在植物體內通過RdRP擴增的siRNA不僅在同一個細胞內維持基因沉默效應，還能通過細胞內的運輸通道送到植物體的其它細胞執行基因沉默功能，甚至把siRNA的功能擴展到整個植物體內[5]，但也有的研究結果并沒有發現RNAi的這種擴散和傳遞效應，而是可以對目標基因實施器官特異性的沉默[6]。

與傳統的理化誘變、T-DNA插入突變等方法相比，RNAi技術的優點為：(1)特異性，RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制，有高度的序列特異性，這使dsRNA能夠非常特異地誘導與之序列同源的mRNA降解，而避免降解與目的mRNA同家族的其它mRNA，從而實現對目的基因的精確沉默；(2)高效性，少量dsRNA就能幾乎完全抑制相應基因的表達；(3)可選擇多效性，通過仔細地選擇靶基因序列片段，可選擇性沉默某一目的基因家族中的單個成員、部分成員或全部成員的表達[4-5]。

2、植物RNAi方法學的特點

要人為對細胞或生物體內的特定基因實施RNAi表達抑制，主要有兩種技術策略。第一種是在體外采用化學法直接合成雙鏈的siRNA，然后采用特定方法導入細胞或機體內，介導靶基因mRNA的降解和基因沉默，此處稱之為外源法，動物中以該法為主。第二種是構建靶基因的反向重復序列(RNAi)表達載體，轉入細胞或機體后，反向重復序列的轉錄本發生分子內雜交而形成dsRNA，從而介導靶基因的沉默，此處稱之為內源法，植物中以該法為主。這兩種策略雖然都能介導靶基因的沉默，但有很大的區別。外源法是一種瞬時表達技術，操作簡單快捷，只能介導靶基因在短時間內的表達沉默，更不具有遺傳性，適合于研究基因功能、分子機理和基因治療效果的探索，但不適合于遺傳改良、資源創新和長效性/永久性基因治療。內源法既可用于瞬時轉化后介導靶基因的短時沉默，也可用于轉化后介導可遺傳的靶基因永久沉默，操作復雜費時，但用途廣泛，效果好，尤其是可用于遺傳改良、資源創新和長效性/永久性基因治療。不僅植物中廣泛使用內源法，動物中也越來越重視內源法的研究與應用[4，7-9]。

目前RNAi已在植物中得到廣泛應用，無論是基因功能驗證還是作物遺傳改良，構建相應的RNAi表達載體都是最基本的試驗步驟和必要方法。在植物RNAi載體構建中，對目標基因有三種表達策略可以達到植物內源基因的RNA沉默：產生雙鏈RNA轉錄本的反向重復RNAi (IR-RNA)策略、反義RNA (anti-sense RNA)策略和正義超表達靶基因(sense RNA)策略。目標基因與載體之間的DNA重組方式中，酶切-連接方式被廣泛應用于各種轉基因植物表達載體的構建，以同源重組為基礎的植物RNAi表達載體構建方法也有一定比例，它不需要限制性核酸內切酶、修飾酶和DNA連接酶[10]，也有人采用以重組PCR技術為基礎結合酶切-連接的植物RNAi表達載體構建方法[11]。植物RNAi表達載體轉化植物的方法主要是依賴于組培再生系統的農桿菌介導的改良葉盤轉化法，其次是依賴于花粉管通道的農桿菌介導的活體植株轉化法、依賴于組培再生系統的基因槍法、活體基因槍法等。幾乎在所有的轉基因方法得到的轉基因植株中，有外源基因在整合進基因組后出現基因沉默的現象。

3、RNAi在植物基因功能、分子機理等基礎研究中的應用

近些年的研究成果表明，植物RNAi技術作為一種下調表達技術，無論是在探索驗證未知基因功能還是作物遺傳改良中都起到了重要作用。2002年11月歐洲的The Arabidopsis Genome RNAi Knock-out Line Analysis (AGRIKOLA)項目啟動，準備用RNAi技術獲得擬南芥所有基因(約25000個)的農桿菌轉化植株，以解析其功能基因組，現在RNAi已是用于植物功能基因組研究的反向遺傳學手段的代表[12]。加州理工大學的Chuang使用此技術研究了擬南芥的AG、CLV3、AP1、PAN這四個開花基因的功能，結果表明使用RNAi技術可以產生功能喪失或降低的突變體，其表型與以前通過其它方法鑒定的突變體類似[13]。Wesley等人報道了帶內含子的發夾環RNA可以有效的使植物中的目的基因沉默，通過RNAi技術發現擬南芥VHA-Cl的RNAi轉基因后代較野生型開花早，葉數少，證明了FLC1基因與花期之間的關系[10]。Brummell等人報道了反向重復的3’端NOS可引起高效高通量的基因沉默[14]。Xiong等人對轉基因番茄的ACC氧化酶進行RNAi研究并分析其影響[15]。

對植物的內源基因表達的干擾技術比較成熟的主要還是RNAi技術和反義RNA技術，其中反義技術更為簡單[16-17]，更適合于對多基因家族的表達抑制。RNAi作為一種反向遺傳學的研究方法，可特異性敲除某一基因的功能，并可通過轉基因技術得到RNAi轉基因植株，省時省力；對多拷貝基因同樣發揮作用；由于RNAi介導的基因功能缺失一般只是部分的，故對于在植物生長發育至關重要的基因，可通過此技術獲得功能下調株。Miki等采用RNAi技術構建了pANDA載體，不僅可用于農桿菌轉化水稻基因，而且能使高效的RNAi載體的構建變得方便快捷，結果證明超過90%的已驗明的轉基因水稻中都觀察到mRNA表達抑制的現象，同時在每一個沉默的植株中都檢測到了指示RNA沉默的短干擾RNA[18]。這些例子顯示，RNAi技術在植物基因功能鑒定等基礎研究中所具有的獨特價值。

4、RNAi在植物性狀改良和資源創新中的應用

4.1RNAi技術在植物營養品質改良中的應用

RNAi用于改善植物營養品質的研究較多。李蘭玉等利用甘藍型油菜種子特異性貯存蛋白基因cruciferin啟動子及NOS終止子構建了無選擇標記基因且含有反義結構的油酸脫飽和酶基因(Fad2)的RNAi表達載體。通過農桿菌介導法，獲得了無選擇標記轉基因植株；再生植株的PCR檢測表明，外源基因已高效地整合到油菜基因組中，而且獲得的轉基因種子通過脂肪酸含量分析表明，油酸含量比對照有了很大的提高[19]。Segal等利用RNAi通過抑制22kD玉米貯藏蛋白基因的表達，培育出高賴氨酸玉米品種[20]。咖啡因可以提神，但飲用過多后易引起心慌、失眠、過度興奮等不良癥狀，使高血脂患者血壓升高，理化法降低咖啡中咖啡因含量的成本高且部分風味喪失，利用RNAi技術則使咖啡中的咖啡因含量降低了50%～70%[21]。李加瑞等利用RNAi技術使小麥胚乳中顆粒結合型淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase I) WAXY基因沉默，得到了直鏈淀粉含量明顯下降的植株[22]。Ganga等利用RNAi技術抑制番茄內源光形態建成調節基因DET1的表達，使類胡蘿卜素和類黃酮含量顯著升高，而果實的其他品質參數沒有發生太大改變[23]。萬群等根據番茄紅素環化酶基因序列構建了siRNAi結構，轉基因番茄果實中番茄紅素含量平均是對照的2.1倍[24]。油菜在相同遺傳背景下黃籽較黑籽具有餅粕蛋白質含量高且抗/非營養物含量低、種籽出油率高、油質清澈等優點，本課題組對類黃酮-原花青素途徑的主要功能位點進行了RNAi和反義抑制[25]，多數轉基因植株表現種皮色素下降等效應，為深入研究有關基因參與決定蕓薹屬種皮色素和莖葉彩色性狀的分子機理奠定了基礎。此外，研究發現抑制程度依賴于干擾片段與靶基因間的同源性水平，即同源依賴型抑制現象，因此可以通過使用大量同源于目標基因的相近或遠緣種來“設計”基因表達的抑制程度，水稻中利用此法創造了低麥谷蛋白品種，給不能消化麥谷蛋白的腎病患者帶來了福音[26]。

4.2RNAi技術在植物抗性中的應用

不同生命體，尤其是在那些缺少免疫機制的生命體中，基因沉默是防衛異源核酸入侵的重要手段。利用RNAi技術在植物中表達產生病毒外殼蛋白基因的發夾雙鏈RNA結構，已被廣泛證明可用于增加各種植物抗病毒病的能力[5]，而且其用于其它抗性研究的報道也越來越多。Huang等通過干擾南方根結線蟲食道腺表達的寄生相關基因16D10，該基因可以作為植物轉錄因子的配基，刺激根系生長形成巨細胞，干擾后的線蟲侵染能力降低63%～90%[27]。Mao等在轉基因植物中表達棉鈴蟲參與棉毒素(棉酚)解毒的P450基因的雙鏈RNA，棉鈴蟲食用了此種轉基因植物后，干擾RNA就滲透入棉鈴蟲消化食物的中腸壁內，P450基因的表達顯著降低，對棉酚的耐受性大大減弱，蠶食棉花的胃口驟減，生長緩慢，甚至死亡，從而降低棉鈴蟲對棉花的危害[28]。石垚等已證明擬南芥EARLI1基因具有抗低溫脅迫和真菌侵染的功能，，EARLI1還與葉片細胞的形態建成有關，能夠在很大程度上調節開花過程，下調EARLI1表達水平會使開花時間明顯提前[29]。

4.3、RNAi技術在農作物其它性狀資源創新中的應用

RNAi還被用于改善花色等觀賞品質、果實貯藏品質等性狀。日本生物研究所使用RNAi技術誘導花色和類黃酮生物合成的關鍵酶查爾酮合成酶(CHS)基因發生沉默，將花由藍色變為白色和粉色，創造了新的商品花卉[30]。曹艷紅等利用反向重復RNA技術成功地干涉了蘋果多酚氧化酶，有利于創造切口褐化變慢的新型蘋果[31]。研究者們通過RNAi技術抑制玫瑰中DFR基因的表達，同時表達F3'5'H，培育出了藍玫瑰[32]。美國于1994年上市了反義抑制多聚半乳糖醛酸酶基因的轉基因番茄，其果實成熟后的軟化較慢，貨架期延長。印度人采用RNAi技術沉默α-甘露糖苷酶(α-Man)和β-D-N-乙酰己糖胺酶(β-Hex)的轉基因番茄在常溫下貯存45d后仍然沒有明顯腐爛，具有很好的商業前景[33]。

雄性不育是高等植物中的一種常見突變體，在農業上具有很大的應用價值，但許多植物中仍然缺乏一些重要類型的雄不育基因型，利用RNAi技術也可以創造一些優良的不育材料。Moritoh等觀察OSGEN-L-RNA的水稻植株，發現一部分育性很低，一部分水稻雄性不育，通過RNAi技術找到了水稻的雄性不育材料[34]。Cigan等利用RNAi技術直接沉默玉米的花粉囊基因表達的啟動子MS45，從而抑制花粉囊的形成，獲得玉米的雄性不育株[35]。

Byzova等通過RNAi技術對擬南芥和油菜的花器官進行改造，抑制BPI基因表達，減少油菜的花瓣數，創造出沒有花瓣但其它功能完整的花，光合作用提高，促進了籽粒中油脂的積累[6]。

隨著RNAi技術不斷成熟，其在植物基因功能研究、生長發育和性狀改良等各個領域將發揮越來越重要的作用。但RNAi的效應因其長度、序列同源性以及其在靶mRNA上的位點不同而有較大差異，所以要求不斷探索和改進載體構建的設計，轉化后定點、定量抑制重要靶基因，并得以穩定、高效表達，從而加速轉基因技術在農業生產中的應用。在植物中，dsRNA介導的RNAi還是防御病毒的重要機制，因此利用其創造抗病毒轉基因新資源具有很大的吸引力。

雖然過去的一些報道表明RNAi比反義RNA的抑制效果更強，但還需要更廣泛和更嚴格的研究結果才能得出最終的結論。對于轉錄因子來講，CRES-T (Chimeric REpressor gene-Silencing Technology)是近些年應用較多的一種新型基因沉默技術[36]，今后需要對其效果與RNAi和反義RNA技術進行客觀的比較。此外，RNAi的擴散傳遞效應的普遍性到底如何、擴大效應的程度和普遍性如何、多基因家族的RNAi的效果到底如何，都還需要更為廣泛和精確設計研究的結果來作出全面而客觀的回答。

（基金項目：重慶市科技攻關項目(CSTC2009AB1030)、國家自然科學基金(30771237)、國家“863”計劃(2006AA10Z110、

2006AA10A113)共同資助。）

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