分枝桿菌BD696-6固定化發酵產雄烯二酮的研究

【摘 要】合成甾體激素類藥物不可替代的中間體是雄烯二酮（AD），日益枯竭的薯芋皂素資源是導致生物學家們不斷嘗試尋找用微生物發酵產生AD的重要因素。植物甾醇可由菌株Mycobacteriumsp.BD696-6(簡稱BD696-6)轉化為雄烯二酮。由于菌體濃度低、發酵周期長、轉化率低等缺點存在于發酵過程中，人們開始積極研究固定化技術對分支桿菌BD696-6的影響。由研究數據可知固定化技術可以有效保護細胞膜的完整性，有效提高目標產物的積累量。通過研究海藻酸鈉包埋法和硅藻土吸附法固定菌體細胞，探索固定化條件及發酵條件對分枝桿菌BD696-6發酵產生AD的影響。

【關鍵詞】細胞固定化；海藻酸鈉；硅藻土；發酵條件；雄烯二酮

大部分的甾體激素類藥物的生產都是以AD為起始原料的，而雄烯二酮（雄甾-4-烯-3，17二酮，簡稱AD）是合成甾體激素類藥物不可替代的中間體。我們既可以用化學方法從野生藥材“穿地龍”中植物提取合成AD，也可以通過降解自然界豐富的動植物甾醇用微生物發酵的方法獲得AD。日益枯竭的薯芋皂素資源使薯芋皂素越來越昂貴，用微生物發酵技術生產AD成了發展甾體藥物的一大趨勢。用這種方法我們不僅可以擺脫“穿地龍”黃姜等原料供應受季節、地域等自然因素的影響及其對生產造成的制約，還可以滿足國內外市場日益增長的對AD的需求，更起了保護自然資源和生態資源乃至人類健康的重大作用。

1.雄烯二酮的結構、性質及生產方法

1.1結構與性質

雄烯二酮的結構式如圖所示，分子式為C19H26O2，分子量為286.45，熔點是173~174℃，白色晶體粉末狀，無異味，無毒性，可燃，溶于乙醇、醋酸、乙醚等有機溶劑，不溶于水。

1.2應用雄烯二酮

雄性激素、蛋白同化激素、螺內酯等藥物主要是由AD生產，雄烯二酮的中間體地位是許多甾體藥物不可替代的，對機體起著非常重要的調節作用。合成19－去甲甾體系列雌激素的重要前體物是AD的類似物ADD，有了AD和ADD我們我們可以合成大部分的甾類藥物。根據研究表明，細胞膜的完整性可以由細胞固定化保護，細胞固定化還可以增強積累目標產物的能力。

1.3雄烯二酮的生產方法

1.3.1傳統生產方法(化學合成法)

由薯蕷植物資源中提取薯蕷皂苷元，化學合成雄烯二酮，然后再以雄烯二酮為中間體合成多種甾體藥物。化學合成法有著復雜的化學工藝，繁瑣的步驟，高價的成本（總成本不下于1000元/公斤），不僅消耗量大還破壞環境等的局限性，人們一直致力于尋找如膽酸、海柯皂苷元和惕告皂苷元等新的天然甾體藥物，將其開發成制造雄烯二酮的原料。

1.3.2微生物轉化法

利用微生物細胞對有機化合物某一特定部位作用，將其轉化為結構上相類似的另一種化合物的方法稱為微生物轉化。利用微生物細胞的酶系對底物的某一特定部位進行催化反應形成最終產物，而不是由營養物質經微生物細胞的一系列代酶過程后轉化的。微生物轉化法如圖所示：

自生產開始實行微生物轉化后，甾體藥物就常采用化學法和微生物轉化法相結合的辦法來生產。這樣可以減少合成步驟、縮短生產周期、提高收獲率，減少發生副反應。

2.對分枝桿菌BD696-6產雄烯二酮的現狀研究

關于分枝桿菌發酵產生AD的研究是目前國內外熱衷的課題之一。其主要集中下面的方面：

2.1菌種的選育

發酵過程的控制及產量直接由菌種的優良來決定的，菌種的優良是影響發酵過程至關重要的元素。

2.2添加抑制劑、優化培養基

經過研究鄰菲羅啉等酶抑制劑對積累ADD的影響，為防止甾核降解我們可以適當添加抑制劑。添加時間是非常重要的，因為抑制劑也有輕微抑制甾醇降解酶的作用。且要將濃度控制到最佳。優化培養基方面：哈爾濱理工大學的車成彬等發現“葡萄糖為碳源不如玉米漿為碳源產率高，并且磷酸鹽充足能提高產率”。總的來說，培養基優化后，在0.2%~0.3%的投料濃度時，一般能將轉化率提高到50%。但轉化率會下降如果再增加底物投料濃度。

2.3利用化學或物理手段將微生物自然固定或定位于限定的空間區域內，保護其固有的催化活性，并能反復使用的技術稱為細胞固定化技術

由于固定化生物細胞可以持續增殖、休眠及衰亡，所以其活性一直保持穩定。除保持原有的識別、結合、催化活性外，固定化的生物細胞還具有易于分離、可重復使用及穩定性提高等顯著優點。

3.對分枝桿菌BD696-6產雄烯二酮的研究

3.1海藻酸鈉固定BD696-6菌株轉化甾醇產雄烯二酮

將微生物細胞包埋在凝膠的微小空格內或埋于半透膜聚合物的超濾膜內的方法稱為包埋法。由于有著化學穩定性好、無毒、包埋效率高且價格低廉等優點，海藻酸鹽成為廣泛運用的包埋固定化介質。用海藻酸鈉包埋菌體，研究在不同包埋菌體量下形成凝膠的特性時的海藻酸鈉、氯化鈣的濃度，經由正交試驗考察凝膠強度、貯藏穩定性以及其對發酵的影響，并找到最適合進行固體化細胞發酵的條件。

考察了固定化細胞的包埋條件對AD轉化率的影響，研究了包埋條件下海藻酸鈉的濃度、氯化鈣濃度及菌體包埋量后，通過正交分析法得到海藻酸鈣固定化細胞的最佳包埋條件：海藻酸鈉濃度為2g/100mL、氯化鈣濃度為1g/100mL、菌體包埋量為15mL/50mL凝膠。縮短了24h的發酵周期，提高了17.93%的AD轉化率。

3.2硅藻土吸附法

吸附法又被稱為載體結合法，通過自然附著力（物理吸附、離子結合）等方式將微生物細胞固定在載體表面和內部形成生物膜。在確定硅藻土為吸附BD696-6細胞的載體后，在建立單因素實驗的基礎上，通過正交試驗優化得到硅藻土吸附菌株條件：載體添加量7g/L，最佳接種量18%，甾醇添加量3g/L、發酵時間168h，但這種固定化體系發酵轉化的重復性不太好。

（1）硅藻土吸附細胞的發酵條件為：pH8.7，發酵溫度32℃，搖床轉速200r/min；添加鐵鋅鎂等金屬離子可提高AD的轉化率達85.64%；甘氨酸可抑制BD696-6細胞壁的合成，提高細胞轉化活性。

（2）5L罐發酵進行放大培養可以提高AD轉化率，驗證了搖瓶發酵的結果。甾醇的含量能提高總產量彌補了其會降低AD的轉化率的不足。

合成甾體激素類藥物不可替代的中間體是雄烯二酮（AD），日益枯竭的薯芋皂素資源是導致生物學家們不斷嘗試尋找用微生物發酵產生AD的重要因素。植物甾醇可由菌株Mycobacteriumsp.BD696-6(簡稱BD696-6)轉化為雄烯二酮。由于菌體濃度低、發酵周期長、轉化率低等缺點存在于發酵過程中，總之，由于固定化發酵體系可以重復利用，我們可以用固定化技術發酵產生雄烯二酮。微生物轉化植物甾醇為雄烯二酮的過程是一個多酶體系參與的生化反應過程。其中涉及到植物甾醇從胞外到胞內的運輸、從胞內到反應點的運送、植物甾醇側鏈切除的酶的調控和雄烯二酮雙鍵和羥基的形成的酶的調控等。在以后發展中，可以從根源上（如基因調控方面）獲得更大進展，為以后實行大規模工業化生產提供理論依據。

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