安徽烏菜SRAP技術體系的優(yōu)化

摘 要： 以合肥黃心烏為試材，利用正交試驗設計，對SRAP-PCR反應體系中的Mg2+ 濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq聚合酶濃度和模板DNA濃度進行5因素4水平的篩選分析，用me3-em3引物組合進行PCR擴增以確定最佳反應體系。結果表明，安徽烏菜SRAP-PCR最佳反應體系為：10×PCR buffer 1 μL，Mg2+ 3.0 mmol·L-1，dNTPs 0.2 mmol·L-1，引物 各 0.5 mol·L-1，模板DNA 4.0 ng·μL-1，Taq聚合酶0.05 U·μL-1，總體積為10 μL。利用此反應體系對安徽烏菜進行PCR擴增并電泳檢測，其結果清晰、穩(wěn)定、可靠，可用于安徽烏菜的遺傳分析。

關鍵詞： 安徽烏菜； SRAP； 正交； 體系優(yōu)化

安徽烏菜是安徽省的著名特產蔬菜之一，起源于南北氣候區(qū)之間，對研究白菜類的進化與分化可提供有價值的線索[1]。同時，安徽烏菜具有很多優(yōu)良性狀和獨特的商品性，如抗寒性、抗病性、耐抽薹、葉面泡皺、口感與風味等，對作物遺傳改良具有重要的利用價值。加快安徽烏菜的分子生物學研究是今后進行烏菜種質資源深度開發(fā)和利用以及遺傳改良的重要保障。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）標記是2001年由美國Li和Quiros[2]發(fā)展的一種基于PCR反應的分子標記技術，其多態(tài)性豐富、重復性好、操作簡便快速、高共顯性、在基因組中分布均勻、易測序以及不需預知物種序列信息的優(yōu)點，使其使用成本相對較低。目前，在多種園藝作物上都建立了SRAP技術體系[3-13]。本研究利用正交試驗設計對安徽烏菜SRAP反應體系進行優(yōu)化，以期得到安徽烏菜的SRAP最佳反應體系，從而為今后的安徽烏菜分子生物學研究提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料由安徽省農業(yè)科學院園藝研究所收集提供（表1），其中合肥黃心烏用作體系優(yōu)化，其他均用作體系驗證。2011年8月在安徽省農業(yè)科學院園藝研究所試驗地播種。試驗使用PCR擴增儀為英國 Techne公司TC-512型。PCR反應的Mg2+、dNTPs、PCR-buffer、Taq聚合酶均購自上海生工生物工程技術有限公司。引物設計參照Li和Quiros發(fā)表的引物序列[2]，由上海英俊生物工程技術有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取 取安徽烏菜的幼嫩葉片，采用Liu等[14]改良CTAB法提取基因組DNA。1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，紫外分光光度計測定DNA濃度，用1×TE緩沖液稀釋至20 ng·μL-1用于擴增分析。

1.2.2 SRAP-PCR反應體系優(yōu)化 采用L16（45）正交試驗設計，從影響PCR反應較大的Mg2+濃度（分別為2.0、2.5、3.0、3.5 mmol·L-1）、dNTPs濃度（分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mmol·L-1）、引物濃度（分別為0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1）、Taq聚合酶濃度（分別為0.05、0.07、0.09、0.11 U·μL-1）和模板DNA濃度（分別為2.0、3.0、4.0、5.0 ng·μL-1）5個因素4個水平對烏菜SRAP反應體系進行優(yōu)化，用me3（5'-TGAGTCCAAACCGGAAT-3'）-em3（5'GACTGCGTACGAATTGAC-3'）引物組合進行PCR擴增以確定最佳反應體系每處理2次重復。體系的各因素濃度水平和正交設計見表2。

1.2.3 SRAP-PCR反應程序 PCR反應在TC-512 PCR擴增儀上進行：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性1 min，35 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共5個循環(huán)；94 ℃ 變性1 min，50 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min；4 ℃ 保存。

1.2.4 PCR擴增產物的電泳與檢測 擴增產物在6% 聚丙烯酰胺凝膠上電泳：60 V功率預電泳30 min，擴增產物加3 μL體積的溴酚藍上樣緩沖液后點樣，于120 V恒壓電泳90 min左右，待溴酚藍電泳至膠板2/3處停止電泳。銀染檢測：10% 的乙醇溶液、0.5% 乙酸溶液固定15 min，0.2% AgNO3溶液染色15～20 min，蒸餾水快速漂洗2次；1.5% NaOH溶液、0.4% 甲醛溶液、1% Na2S2O3 0.33 mL·L-1顯色至譜帶清晰時停止，蒸餾水漂洗凝膠2～3 min，進行拍照、分析。

1.2.5 SRAP-PCR優(yōu)化體系的驗證 采用SRAP-PCR已優(yōu)化的反應體系，對37份安徽烏菜材料DNA進行擴增，以驗證該體系的效果。

2 結果與分析

2.1 SRAP-PCR擴增反應體系的確立

試驗結果表明，16個組合中，由于Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶、引物和模板DNA等5個影響因素濃度組合的不同，擴增結果存在著明顯的差異（圖1）。組合10擴增效果最佳，條帶豐富、清晰、穩(wěn)定。組合1、5、6、9、11、13、14、15、16擴增的條帶較弱，擴增的效果較差；組合7、8擴增的條帶背景較深；組合2、3、4、12雖然條帶清晰，但條帶數相對較少，重復性稍差。由圖1可知，在正交組合范圍內，安徽烏菜SRAP-PCR最佳反應體系為：10×PCR buffer 1 μL、Mg2+ 3.0 mmol·L-1、dNTPs 0.2 mmol·L-1、引物0.5 μmol·L-1、模板DNA 40 ng·μL-1、Taq聚合酶0.05 U·μL-1，反應體系的總體積為10 μL。

2.2 最佳反應體系的穩(wěn)定性檢驗

應用上述最佳反應體系，用me2（5'-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′）-em6（5′GACTGCGTACGAATT GCA-3′）引物組合對37份安徽烏菜DNA進行SRAP擴增，結果見圖2。引物對每份DNA樣品均擴增出清晰的條帶，并且表現出較好的多態(tài)性，說明該體系穩(wěn)定可靠，能夠滿足安徽烏菜基因組DNA的SRAP擴增要求，應用于安徽烏菜的遺傳分析是可行的。

3 討 論

SRAP標記是針對開放閱讀框（ORFs）進行擴增的，因不同個體和物種的啟動子、內含子與間隔長度不同而產生多態(tài)性。不同作物的SRAP-PCR反應體系往往是有很大差異的，本研究采用正交優(yōu)化設計方法建立了可用于安徽烏菜遺傳相關研究的SRAP體系，相比較單因素篩選優(yōu)化，減少了處理組合，節(jié)省了人力和財力，能更快速的獲得滿意的試驗結果。

在優(yōu)化SRAP反應體系過程中，由于不同作物基因組差異和所用藥品儀器不同，PCR反應體系中各因素最適用量存在一定的差異。本研究針對安徽特有蔬菜品種烏菜進行了SRAP系統優(yōu)化研究，主要對反應體系中各因素濃度對結果影響進行了探討。結果表明，各因素對擴增反應結果均有不同影響，其中以Mg2+濃度和dNTPs濃度影響最大。低Mg2+濃度下，擴增條帶較模糊，隨著Mg2+濃度的增加，擴增條帶逐漸清晰；在低Mg2+濃度下，隨著dNTPs濃度的增加，擴增條帶逐漸增多，且條帶顏色逐漸加深；當Mg2+濃度大于3.0 mmol·L-1時，增加dNTPs濃度變化不大；在低dNTPs濃度下，增加Mg2+濃度，擴增條帶增加，而在高的dNTPs濃度下，增加Mg2+濃度不能明顯增加擴增條帶；引物濃度在0.2～0.5 μmol·L-1之間擴增條帶無明顯差異，但在低引物濃度下，擴增條帶顏色較淺，隨著濃度的增加，擴增條帶顏色逐漸加深；Taq DNA聚合酶濃度和模板DNA濃度在反應體系中對擴增結果影響較小，在一定范圍內幾乎無差異，主要是通過與其他因素互作而影響擴增效果（圖1）。單曉政等[9]對不結球白菜SRAP反應體系進行優(yōu)化，確立了適合不結球白菜的SRAP反應體系，相比之下，本研究結果除了在dNTPs用量上相同外，其余均有差異，這與李媛等[6]結論一致，即在今后其他十字花科作物的SRAP體系優(yōu)化工作中，可以對Mg2+、引物及其DNA濃度方面進行重點優(yōu)化。

本研究利用優(yōu)化的SRAP反應體系對37份不同的安徽烏菜資源進行分析，結果表現為多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好、重復性好等特點，說明該體系適合于安徽烏菜的遺傳分析，這可為今后安徽烏菜種質遺傳改良研究提供參考。

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