茄果類親緣關系的RAPD研究進展

摘 要： 為了更準確地測定茄果親本間的親緣關系，提高育種效率，RAPD分子標記技術被廣泛運用于茄果親緣關系的研究中。本文綜述了RAPD技術的原理和特點、茄果親緣關系的試驗方法以及聚類分析法研究進展，以利于人們對RAPD技術在茄果親緣關系研究中的應用有更深入的了解。

關鍵詞： 茄果； RAPD； 親緣關系

茄果種質資源的遺傳多樣性和親緣關系研究是開展茄果遺傳改良、促進茄果生產可持續發展的重要基礎工作。

茄果類蔬菜的種質資源極為豐富，種質資源親緣關系研究是蔬菜育種工作的重要組成部分，而DNA分子水平上的遺傳多樣性更有助于闡明親緣關系和正確分類。

隨著新的有效的分子標記方法不斷涌現，包括RAPD標記在內的各種基因型鑒定手段被廣泛運用于植物種類研究中[1-2]。RAPD技術材料用量少，效率高，引物通用性和廣泛性強，能直接反映DNA水平上的差異，且不受季節和環境條件的限制，在茄果類蔬菜品種親緣關系的研究中被廣泛應用。

1 概 述

RAPD技術是Williams等[3]在PCR技術的基礎上建立的新型分子標記方法，采用人工合成的具有9～10個寡核苷酸的隨機引物， 進行DNA擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠上電泳， 經EB染色后檢測擴增產物的多態性。將RAPD分子標記結果進行分析，在DNA分子水平上為物種進化和分類提供了有力證據，對生物的品系（種）鑒別和起源演化方面的研究具有重要意義。

RAPD技術在引物足夠多的情況下可以檢測整個目標基因組的DNA多態性，通過不同引物反應基因組的遺傳多樣性，找到近緣種間的遺傳物質差異，從而表達種質間的遺傳差異，從基因水平上區分作物種間關系，明確鑒定其親緣關系的遠近，為茄果種質親緣關系的確立提供科學依據。

韓永升等[4]采用RAPD技術對辣椒7個親本和6個雜交組合進行遺傳差異和親緣關系的研究，經聚類分析，可把13個不同辣椒品系分為7個大類。朱海山[5]等用RAPD技術檢測了27份番茄材料的遺傳多樣性，并對其進行了聚類分析，結果表明，供試品種被劃分為6大類群，其分類與形態學上的分類基本一致。冉進等[6]利用RAPD技術對來源于國內外的53份參試茄子種質分為5大類群，其聚類結果與傳統分類并不完全一致，與地理分布沒有關系。

2 PCR-RAPD試驗方法研究進展

以提取的符合試驗要求的DNA為模板，篩選出擴增條帶清晰且多態性較好的引物用于RAPD-PCR擴增，使用瓊脂糖電泳法測定，在紫外光下檢測PCR擴增產物并拍照。

RAPD技術使用的引物較短，要求退火溫度較低，提高了引物和模板的配對幾率和隨機性，大大地提高了基因組分析的效率和多態性的檢出，但也會導致標記的穩定性和可重復性差等缺點，因此RAPD試驗條件的標準化十分重要。選擇合適的RAPD引物，建立相對穩定的RAPD反應體系和擴增程序是RAPD技術應用的基礎。

2.1 RAPD引物篩選

進行RAPD試驗時，隨機引物的正確選取對實現RAPD-PCR有效擴增十分關鍵，應選用多態性強、擴增重復性好、條帶清晰且較多的引物。

李洪濤等[7]從上海申友公司生產的160個BS序列的隨機引物中篩選得到36個在PCR擴增中多態性豐富的引物，從中選用了11個對27個供試材料進行擴增，全部得到了較豐富的多態性。Thul等[8]從40個RAPD隨機引物中篩選出27個用于22個辣椒品種的鑒定和物種特異性描述。陳學軍等[9]以辣椒屬5個栽培種的13份材料中形態差異較大的2個供試材料DNA為模板， 進行RAPD隨機引物的篩選，從120個引物中篩選出擴增條帶清晰、重復性高的引物23個進行RAPD分析。李晴等[10]從115條RAPD隨機引物中選出11條對37份辣椒材料進行PCR擴增， 得到多態性條帶36條，以此分析辣椒遺傳多樣性和種質親緣關系。Ince等[11]在RAPD-PCR反應的基礎上利用2 760個RAPD分子標記，分析了辣椒屬24個品種的親緣關系。

2.2 RAPD-PCR反應體系

RAPD的基本反應程序就是PCR反應，模板DNA濃度、質量、引物濃度、Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶的種類及濃度、反應程序等均會影響RAPD擴增結果，因而只有研究出最適反應體系，才能獲得最理想的RAPD圖譜。

由于不同的生物、不同的引物對反應體系的要求不同，在進行RAPD研究時，首先參照基本的反應體系進行PCR擴增，然后對擴增產物明顯的引物進行反應體系的優化及其引物篩選，再進行遺傳標記或遺傳多樣性等研究。

目前，針對不同茄果所采用的反應體系大同小異，應注重DNA濃度、MgCl2濃度、dNTP、Taq酶、引物濃度等方面的優化，以尋求最佳反應體系。

2.2.1 反應體系的選擇 進行RAPD試驗前，需要根據試驗條件選擇適宜的RAPD反應體系，即反應體系是建立在多少體積上的，一般采用10 μL，20 μL，25 μL反應體系。陳杰等[12]利用10 μL的反應體系，57個RAPD引物標記對16份茄子材料進行遺傳親緣關系分析。張曉煜等[13]在進行番茄種質資源遺傳多樣性的試驗時，采用20 μL的RAPD反應體系。林清等[14]利用25 μL反應體系的RAPD技術對不同來源、不同類型的34份加工型辣椒種質資源進行聚類分析。

2.2.2 反應體系的優化 在前人的基礎上，對所選擇的反應體系進行優化，即比較篩選RAPD擴增體系的各影響因素，建立RAPD-PCR反應的最佳體系。

模板DNA濃度過低會導致擴增結果不穩定，過高則導致引物或dNTPs過早耗盡， 出現擴增條帶不穩定的現象。Mg2+是Taq 聚合酶的激活劑， Mg2+濃度過低時， 酶活力顯著降低， 酶會催化非特異的擴增。Taq酶的活力與RAPD擴增產物的質和量密切相關，酶活力的有無、高低直接影響著擴增結果，另外還應考慮到酶的污染問題。dNTPS濃度過高， 會導致聚合酶錯誤地摻入， 濃度過低會影響合成效率。引物濃度隨模板DNA濃度而定， 引物濃度過低無法檢測出所有RAPD位點， 濃度過高會產生引物二聚體，還會導致非特異性擴增的增加。

2.2.2.1 回歸分析的方法 PCR體系優化采用二因子全實施和單個因子的試驗，設置試驗各因子的水平，采用λDNA建立標準曲線，對每次擴增產物的電泳進行標定，確定各處理擴增產物的產量。采用逐步回歸分析的方法建立模型，對入選因子分別建立方程，最后對入選因子進行優化分析。張子學等[15]以辣椒為材料，采用回歸分析的方法對RAPD體系進行優化研究，得到20 μL體系中主要因子的優化組合。

2.2.2.2 單因素多水平梯度試驗 對RAPD試驗中的不同反應成分的濃度分別設置梯度，在對某一成分的梯度進行篩選時，保持其他成分不變，調整ddH2O的用量，使總體積保持不變。通過RAPD擴增條帶結果比較，得出試驗最佳體系。吳雪霞等[16]通過單因素多水平梯度試驗，比較篩選RAPD擴增體系的各影響因素，建立了茄子RAPD-PCR的最佳反應體系。

2.2.2.3 正交設計優化 根據正交法對DNA模板濃度、 dNTPs、Mg2+濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度5個因素設置濃度梯度，每個因素選定4個濃度水平，選用正交試驗表L16（45）安排試驗。試驗為5因素，4水平試驗，16個組合。通過分析試驗的電泳圖譜，得出試驗因子的最佳組合。宗憲春等[17]利用正交設計建立了辣椒基因組適用的簡單、穩定和重復性較好的RAPD-PCR反應體系。

RAPD分析的穩定性和重復性在實際應用中存在一些問題，因而優化體系的建立十分重要?；貧w分析是通過數理統計分析方法處理試驗，得出試驗要素之間的相關關系，以相關系數的大小來判斷因子之間的相關的程度，使試驗結果數字化，更加客觀。單因素多水平梯度試驗，對每個因素的最佳水平進行摸索，需要進行多次的梯度試驗，過程繁瑣且不能兼顧到各因素間的交互作用。正交法設計，充分考慮RAPD-PCR反應中每個因素同時變化對反應的影響，通過1次試驗就得到了最佳反應體系，大大簡化了試驗過程，節省了時間，降低了試驗成本。

3 聚類分析方法研究進展

PCR-RAPD擴增結果一般采用聚類分析。聚類分析是直接比較各事物之間的性質，將性質相近的歸為一類，將性質差別較大的歸入不同的類。在系統聚類分析中，用戶事先無法確定類別數，系統將所有例數均調入內存，且可執行不同的聚類算法。系統聚類分析有2種形式，一是對研究對象本身進行分類，稱為Q型聚類；另一是對研究對象的觀察指標進行分類，稱為R型聚類。

聚類結果可以初步反映各材料之間的遺傳關系遠近，建立親緣關系圖，從而得出茄果的親緣關系。

3.1 NTSYS軟件分析法

擴增結果采用二元性編碼，把某一條帶的有無2種狀態即每個RAPD擴增的條帶記錄為1個遺傳位點，將同一引物、同一位點，有DNA擴增帶記為1，無帶記為0，形成1/0矩陣。

試驗的相似系數采用Nei和Li的公式：Sij=2a/[（a+b）+（a+c）]，公式中Sij代表2個材料i和j之間的相似系數，a為2個材料共用的條帶數，b為材料i有而j沒有的條帶數，c為材料j有而i沒有的條帶數。GD（遺傳距離）=1-GS（遺傳相似系數），利用NTSYS軟件進行Nei-Li遺傳相異系數分析，用SAHN（sequential，agglomerative，hierarchical and nested clustering）功能，按照非加權配對算數平均法UPGMA法（unweighted pairgroup method and arithetic average）進行聚類分析，再用Tree Display功能繪出聚類分析樹狀圖。

陳學軍等[18]應用NTSYS軟件進行遺傳相似系數和聚類分析，得到31個辣椒品種的親緣關系樹狀圖。

3.2 SPSS軟件分析法

用Quantity One一維凝膠分析軟件自動讀取RAPD擴增產物，有條帶的記為1，無條帶的記為0，系統自動生成1與0形式的報告單。

將報告結果錄入POPGENE 1.31，計算RAPD擴增產物的多態位點數（number of polymorphic loci）、多態位點比例（percentage of polymorphic loci）、Shannon多樣性指數、Nei’s指數、每位點有效等位基因數（effective number of alleles，NE）、遺傳離散度（Ht）和遺傳分化系數（Gst）。利用SPSS11.0分析軟件中的Jaccard法和Within-group linkage進行聚類分析，以Fartherest neighber聚類分析方法計算并建立親緣關系樹狀圖。

王秋錦等[19]用SPSS 11.0分析軟件對34份茄子的RAPD擴增結果進行聚類分析，從分子水平上檢測了茄子的遺傳多樣性。

3.3 DPS軟件分析法

對RAPD標記數據進行二元性編碼，形成0，1矩陣。采用DPS 7.05軟件進行Nei-Li相異系數分析，根據遺傳相異系數矩陣，通過非加權配對算術平均法（UPGMA）進行聚類分析，建立自交系材料親緣關系圖。

溫慶放等[20]對32個櫻桃番茄品種進行RAPD 分析，運用DPS軟件生成聚類圖，從而對遺傳多樣性和分類進行探討和研究。

4 問題及展望

RAPD-PCR的擴增能力很強，即使反應混合物中只含有1個拷貝的靶DNA分子，也能被有效擴增，所以任何DNA樣品或試驗試劑均應仔細避免發生被污染的可能性，同時也意味著分子生物學分析現在已經可以應用于只含有痕量DNA的樣品。

就目前RAPD標記研究現狀來說，其可靠性已基本上得到了肯定。但在應用上還是有不少問題出現，如前后試驗結果不一致、不同人之間的結果不能比較等。這些往往是由于前后試驗，不同人之間采用了不同反應條件所引起的。

不容忽視的是，RAPD 標記是1個顯性標記，存在共遷徙問題，試驗穩定性和重復性較差。而且，由于RAPD技術應用費用昂貴，試驗條件要求高，國內農業科技工作者對它們的認識掌握局限等因素，還沒有被多數科研單位和科研人員運用，僅局限在設備條件較好的少數單位。盡管RAPD的再現性備受爭議，RAPD標記仍被廣泛應用于植物和動物的DNA指紋識別和圖譜學習[21-22]。

利用RAPD擴增體系對茄果種質資源進行分類和品種鑒定，得出的親緣關系是較為可靠的，這是由于RAPD分類的依據是以DNA模扳擴增的多態性DNA片斷進行聚類分析的結果，而不是形態特征或表現形式的分類。可以預見， RAPD技術在不久的將來會在植物親緣關系研究中發揮更大作用。

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