種子處理對西瓜細菌性果斑病的防治效果

摘 要： 利用干燥與藥劑相結合、引發與藥劑相結合的種子采后處理方法對西瓜種子的除菌效果進行了研究。應用PCR方法檢測未經人工接種的西瓜種子，幼苗生長方法檢測人工接種和自然帶菌（Ac）的西瓜種子，結果表明，未經人工接種的西瓜種子中，從沒有發酵經室內陰干4 h后熱風烘干、以及不管是否發酵室內陰干的種子上均檢測到Ac菌的特異性條帶。人工接種Ac菌的西瓜種子隨著室內陰干時間的延長，幼苗細菌性果斑病（BFB）的發病率呈上升的趨勢，由陰干 3 h的0.9% 上升到陰干 6 h的20.4%。同時隨著陰干時間的延長，種子的成苗率降低，由陰干 3 h 的52.6%下降到陰干6 h的23.9%。說明快速干燥能有效控制帶菌種子幼苗BFB的發生，提高種子的健康質量。不同殺菌劑對自然帶菌（Ac）西瓜種子殺菌效果的研究結果表明，不管是藥劑處理種子還是含藥的固體基質引發處理種子，其種子質量都沒有顯著的差別。藥劑處理的種子平均每株幼苗的鮮質量均高于含藥的固體基質引發處理的種子幼苗的鮮質量。通過幼苗生長鑒定，含藥固體基質引發處理的相對防治效果在57.1%～78.6%之間，而藥劑處理的相對防治效果在84.6%～100.0% 之間。含藥的固體基質引發處理對降低幼苗BFB發病率的效果要差。

關鍵詞： 西瓜； 細菌性果斑病； 種子處理； 快速干燥； 防治效果

瓜類細菌性果斑病（Bacterial Fruit Blotch，簡稱BFB）是一種嚴重危害葫蘆科作物的世界性病害，尤其以危害西、甜瓜為重。西瓜細菌性果斑病最早于1965年由Webb等[1]首次在美國佛羅里達州發現，并對癥狀進行了描述。當Somodi[2]和Rane[3]等人報道了1989年在美國佛羅里達商品西瓜生產中的發病情況，接著先后在美國東南部10多個州再度嚴重發生西瓜細菌性果斑病，并導致嚴重的經濟損失后，才真正引起了人們的重視，并稱之為西瓜細菌性果腐病。該病一旦發生，即可能造成嚴重的經濟損失。從1989年以來，大多數年份美國發生該病的地塊不到5%，但是一旦受害，其損失有99%～100%。該病在美國印地安納州迅速蔓延后，80%的西瓜不能上市銷售。西瓜細菌性果斑病已對美國的西瓜制種業和種植業造成了巨大的沖擊和重大的威脅。目前該病還在土耳其[4]、澳大利亞[5]、日本[6]等國造成嚴重危害。

我國在1990年首次報道了BFB，隨后就相繼有人記載和報道了該病在國內許多西甜瓜產區的發生和危害[7-11]。該病發生在育苗階段，可造成嫁接幼苗大量死亡，在大田發生可造成西甜瓜減產甚至絕收，給西甜瓜生產帶來巨大的經濟損失。瓜類細菌性果斑病可經種子傳播，我國作為國際上很多大型種子公司的制種基地，由于細菌性果斑病的發生，使得美國的部分瓜農不愿意使用中國生產的種子，致使國際上一些瓜類制種商先后撤出中國，使中國的西瓜制種業蒙受了巨大的經濟損失。

該病主要通過種子帶菌傳播，在生產上使用健康無菌的種子是防止細菌性果斑病發生和傳播的關鍵措施，目前迫切需要行之有效的種子滅菌處理技術。國外有關種子滅菌處理早有報道[12-14]，目前我國也有不少相關研究[15-19]，但是單一一種處理方法都無法對種子進行完全消毒。本研究旨在摸索多種方法的綜合應用對采后種子進行處理，從而減少種子帶菌給西甜瓜生產所造成的巨大損失。

1 材料和方法

1.1 快速烘干對西瓜細菌性果斑病種子帶菌的影響

1.1.1 試驗材料 試驗選用2種類型的種子：不經人工接種的西瓜種子、人工接種的西瓜種子。從沒有發現西瓜細菌性果斑病疫情的大田新鮮西瓜上采集種子作為不經人工接種的西瓜種子，分成2部分：一部分種子馬上沖洗干凈，另一部分種子發酵48 h，沖洗干凈，分別分成4份進行以下處理：（1）馬上烘干，烘干時間為3 h；（2）室內晾4 h后烘干；（3）1% 鹽酸處理15 min后烘干；（4）室內自然晾干。種子的帶菌情況采用幼苗生長和PCR技術對以上處理的種子進行檢測。

人工接種的西瓜種子從市售的健康西瓜上采集，沖洗干凈后分成5份，其中4份立即用濃度為3×104 cfu·mL-1細菌性果斑病菌懸浮液浸泡30 min并進行以下處理：（1）立即烘干；（2）室內晾3 h后烘干；（3）室內晾6 h后烘干；（4）室內晾9 h烘干。另外 1份在室內自然晾干后，在新鮮的西瓜汁液中浸泡2 h，然后用濃度為3×104 cfu·mL-1細菌性果斑病菌懸浮液浸泡30 min，自然晾干，采用幼苗生長檢測發病情況。

1.1.2 種子干燥處理 使用5HG-3550型滾筒烘干機在40 ℃ 的條件下烘干種子。種子快速烘干機是由北京蔬菜研究中心和現代農裝科技股份有限公司共同研制的。

1.1.3 Ac菌懸液的制備 供試菌株為Pslbtw 20，由中國農業科學院植物保護所提供；挑取保存的供試菌株在YDC斜面培養基上活化培養24 h，用無菌水配成菌懸液，利用紫外分光光度計在波長600 nm測量菌懸液的OD值，用無菌水調整OD值在0.1左右（菌液濃度約為1×108 cfu·mL-1），再稀釋至3×104 cfu·mL-1，備用。

1.1.4 幼苗生長鑒定 幼苗生長鑒定在50穴的育苗盤內進行，基質為經高壓滅菌的蛭石，每一個穴內播種1粒種子，育苗盤播種后用薄膜覆蓋保濕，放置在25～30 ℃、16 h光照的條件下生長，出苗后去掉薄膜，每天觀察幼苗的發病情況，直到播種后3周。

1.1.5 種子帶菌的PCR檢測 提取種子的浸提液進行PCR，每個處理檢測1 000粒種子混合樣品。PCR的引物組合為WBF1（5’-GAC CAG CCA CAC TGG GAC-3’）和WBF2（5’-CTG CCG TAC TCC AGC GAT-3’），由北京賽白盛公司合成。種子的浸提及PCR的方法按照宋順華等[20]的方法進行。

1.2 藥劑處理帶菌種子對種子質量的影響及防治效果

1.2.1 試驗材料 供試藥劑：選用6種常用抗細菌的藥劑配制藥液，每種藥劑2個濃度，以無菌水和不處理作為對照：1%鹽酸，2%鹽酸；3%雙氧水，5%雙氧水；3%過氧乙酸，5%過氧乙酸；1 ∶ 100 physan 20，1 ∶ 80 physan 20；0.1% CuSO3，0.2% CuSO3；0.2% 農用鏈霉素，0.4% 農用鏈霉素。

種子：帶菌的西瓜種子為京欣2號，由北京蔬菜研究中心西瓜課題組提供。

采用2種方法處理種子。方法1：用以上濃度的藥液直接處理帶菌的西瓜種子。鹽酸溶液處理種子10 min，physan 20處理種子15 min，其他處理種子20 min，然后充分沖洗干凈。沖洗干凈的種子置于室內自然晾干，保存在低溫條件下備用。方法2：藥劑處理與固體基質引發結合。按照本試驗室引發西瓜種子的方法[21]將以上濃度的藥液加入到固體基質中處理種子，回干后的種子保存在低溫條件下備用。

1.2.2 種子發芽率和幼苗生長特性的測定 處理后的種子分別進行發芽試驗：每處理50粒種子，4次重復，共200粒種子，發芽基質為蛭石，發芽條件為25 ℃恒溫、16 h光照、8 h黑暗，計算種子的發芽勢、發芽率。發芽后14 d測定幼苗的生長特性，連根拔出種苗，用水洗凈后放在濾紙上吸去多余水分。每處理隨機抽取50株苗，測量每株苗的長度，稱量50株苗的總質量，計算平均每株苗的長度和鮮質量。

1.2.3 防病效果的檢測 每處理播種500種子進行幼苗生長鑒定，檢測各處理的滅菌防病效果，檢測方法同1.1.4。

2 結果與分析

2.1 快速烘干對種子帶菌的影響

對大田新鮮西瓜上所采集的西瓜種子進行各種處理后，采用幼苗生長鑒定方法檢測各處理幼苗細菌性果斑病的發病情況。由于所有處理種子所生長的幼苗都很弱小，而且猝倒病嚴重，幼苗的成活率很低，特別是室內自然晾干的種子幼苗的成苗率更低，沒有有效地觀察到幼苗的發病情況。

應用PCR技術，從沒有經過發酵在室內晾干4 h后烘干的種子，以及不管是否經過發酵，在室內自然晾干的種子上均檢測到了病原菌Ac的特異性條帶（360 bp），結果為陽性。不管是否對種子發酵，采種后快速烘干、鹽酸處理的種子及發酵后在室內晾干4 h的種子均沒有檢測到Ac的特異性條帶（圖1），說明種子發酵、采種后快速烘干、鹽酸處理均可阻止病原細菌在種子表面的繁殖，是防止種子帶菌的有效方法。

人工接種的西瓜種子采用幼苗生長方法檢測結果表明，用菌懸液處理后的西瓜種子隨著室內晾干時間的延長，幼苗細菌性果斑病的發病率呈上升的趨勢，晾干 3 h以上時，幼苗的病株率急劇上升，由0.9%上升到晾干 6 h的20.4%。但是隨著晾干時間的延長，幼苗的死亡數量也在增加，成苗率降低，晾干 3 h以上時，種子的成苗率急劇降低，由52.6%下降到 6 h的23.9%（圖2）。由此說明種子的快速烘干可以降低西瓜種子的帶菌率，降低幼苗細菌性果斑病的發病率，提高種子的健康狀況。

Ⅰ. 立即烘干；Ⅱ.室內晾3 h后烘干；Ⅲ.室內晾6 h后烘干；Ⅳ.室內晾9 h烘干；Ⅴ.自然晾干

2.2 藥劑處理帶菌種子對種子質量的影響及防治效果

2.2.1 藥劑處理對西瓜種子質量的影響 不管是藥劑處理的種子還是含藥的固體基質引發處理的種子，其發芽勢和發芽率與對照相比在5%的顯著性水平上都沒有明顯的差別，各處理之間也沒有明顯的差別（表1）。但藥劑處理的種子平均每株幼苗的鮮質量均高于含藥的固體基質引發處理的種子（圖 3）。

2.2.2 不同藥劑處理對西瓜細菌性果斑病的防治效果 通過幼苗生長鑒定，與對照相比，本文所選用的殺菌劑采用2種方法處理帶菌種子后，都顯著地降低了幼苗細菌性果斑病的發病率，各處理種子幼苗的發病率遠遠低于未處理的對照種子，對照幼苗的發病率為5.5%～6.0%，含藥固體基質引發處理西瓜幼苗的發病率在1.5%～3.0% 之間，藥劑直接處理種子幼苗的發病率在0～1.0%之間（圖4），其相對防治效果分別為57.1%～78.6%、84.6%～100.0%（圖5）。含藥固體基質引發處理種子對降低幼苗發病率的效果更差。

3 討 論

瓜類細菌性果斑病是一種典型的種傳病害，種子帶菌是主要的初侵染源，在合適的環境條件下，少量的帶菌種子能給葫蘆科作物生產田造成毀滅性的危害[22] ，因此帶菌的種子可成為商品西瓜甜瓜產區的重大隱患。生產健康的種子，防止種子帶菌和對帶菌種子進行滅菌處理是有效控制該病在田間發生發展的主要措施之一[23]。健康種子的生產首先要避免從出現BFB疫情的大田及帶有典型BFB癥狀的西瓜上采種，但從沒有BFB典型癥狀的西瓜上所采收的種子也很難確定種子是否帶菌。其次種子采后進行種子發酵和酸性物質處理能極大地降低種子的帶菌率，如果在氣溫較低的條件下，發酵24 h的處理效果不理想，發酵72 h對種子的發芽率會產生影響，以發酵36～48 h較為適宜，但沒有100% 的有效[13-14]，因為病原菌可以侵染到種子的內部[24]，種子發酵不能殺死種子內部的病原菌，也有可能是種子發酵后在干燥過程中再次感染病原菌。

本研究采種的大田西瓜植株沒有發現BFB，所采集的西瓜種子籽粒很小，在苗盤播種后發芽整齊但很弱小，因此在有利于BFB發病的高溫高濕條件下猝倒病嚴重，造成成苗率很低，沒有有效的檢測到幼苗BFB的發病情況。本試驗采用PCR方法，不管是種子發酵還是不發酵，從采種后立即烘干的種子、鹽酸處理過的種子以及發酵48 h 后晾干4 h以內迅速干燥的種子上均沒有檢測到病原菌的特異性DNA片段。采用幼苗生長方法檢測人工接種病原菌的西瓜種子，隨著室內晾干時間的延長，幼苗BFB的發病率上升，幼苗的成苗率降低；晾干 6 h種子的成苗率與晾干3 h相比急劇下降，其中一部分原因是幼苗的猝倒病而引起的。由此說明種子的快速干燥可以降低西瓜種子的帶菌率，從而降低幼苗BFB的發病率，提高種子的健康質量。本研究的結果表明，采后使種子表面干燥的時間不能超過4 h，種子發酵、采種后快速干燥、鹽酸處理均可阻止病原細菌在種子表面的繁殖，將這些處理措施綜合使用是防止種子帶菌的有效方法。

殺菌劑處理帶菌種子的研究結果表明，生產上經常使用的6種抗細菌的藥劑分別用2種方法和2種濃度處理種子后，與對照相比，對種子的發芽勢和發芽率都沒有影響，但幼苗的平均鮮質量在2種方法之間有明顯的差別，除5% 的雙氧水外，其余的殺菌劑用含藥的固體基質處理后，與藥液直接處理種子相比，可減輕幼苗的鮮質量。這可能是含藥的固體基質處理種子是一種引發的過程，處理時間較長，在這個過程中種子緩慢吸收了藥液到種子內部，對幼苗產生影響。從各處理對幼苗BFB的防治效果可以看出，相同濃度的藥液通過固體基質引發處理種子，其殺菌效果遠遠不及藥液直接處理種子。本試驗中將一定濃度的殺菌劑加入固體基質，是為了使種子引發與殺菌同時完成。以后的研究還需進一步摸索固體基質中藥劑的種類和適宜的濃度，達到既能使種子不攜帶病原菌又不影響種子質量、出苗整齊的目的。

4 結 論

快速干燥可以降低西瓜種子上Ac的帶菌率，從而降低幼苗BFB的發病率，提高種子的健康質量，采后使種子表面干燥的時間不能超過4 h，種子發酵、采種后快速干燥、鹽酸處理均可阻止病原細菌在種子表面的繁殖，將這些處理措施綜合使用是防止種子帶菌的有效方法。所選用的藥劑和濃度，不管是藥劑直接處理種子還是含藥的固體基質引發處理種子，其種子質量都沒有顯著的差別。藥劑處理的種子平均每株幼苗的鮮質量均高于含藥固體基質引發處理的種子，含藥固體基質引發處理對降低幼苗BFB發病率的效果比藥劑直接處理種子要差。

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