mRNA 差異顯示技術研究綜述

摘要：分析一對細胞或組織在不同狀態下基因表達的差異，已成為分子生物學研究領域的熱點之一，用于識別差異表達基因的方法有多種，DDRT-PCR 是近年來較為廣泛應用的一種技術。DDRT-PCR 技術有很多優點，但同時也存在不少問題，通過對其進行不斷地改進使這項技術在分子生物學中能更好更廣地應用。

關鍵詞：mRNA；差異顯示；PCR

中圖分類號：Q343 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）04-0068-03

高等生物的細胞中約有1.5萬個基因處于表達狀態，但只有15%的基因得以表達。基因的差異表達不僅是細胞形態和功能多樣性的根本原因，同時也是各種生理及病變過程的物質基礎。比較不同細胞間或同一細胞不同時間與空間基因表達的差異，分析與病理變化相關的特異性表達基因，對生物學及相關學科的研究有重要意義[1]。

20世紀90年代初，Bauer等[2]在AP-PCR 和RT-PCR 技術的基礎上建立了mRNA 差異顯示或稱差異顯示逆轉錄PCR（Differential Display reverse transcription PCR，DDRT-PCR），是一種有效的篩選差異表達基因的方法。1994年Erric Haay等將這種方法正式命名為差異顯示反轉錄聚合酶鏈式反應（DDRT-PCR）。與研究DNA 差異相比，研究mRNA 的差異排除了非編碼區的影響，使研究范圍縮小到表達基因水平上，為人類進一步了解生命過程提供了一個工具。

1 mRNA 差異顯示技術的原理及技術路線

mRNA 差異顯示技術是在轉錄水平上對基因表達進行分析的。成熟的mRNA的 3′端具有poly（A）尾巴，以一系列Olige（dT） 12MN 引物中的一種（M、N分別代表A、C、T、G四種堿基中的一種，M 不能為T）錨定于兩種或兩種以上一條mRNA，再于變性PAGE膠上分離目的片段，并就基因表達的差異對比材料的mRNA的poly（A）尾部。在反轉錄酶的作用下，逆轉錄真核細胞中全部表達的mRNA，可獲得1/12 cDNA，同時5′端設計一組隨機引物，通過PCR 擴增，進行比較。將有差異的基因片段從凝膠上切割下來，用相同的錨定引物和隨機引物對分離的片段進行二次擴增，得到差異片段后將該片段克隆、測序，并同基因庫的序列進行同源性比較或者將差異顯示的DNA 克隆測序后作為探針，進行斑點雜交和Northern 印跡確保是否是真陽性結果，以進一步分析其功能。

2 實驗材料的選擇

在細胞或組織選擇方面應盡可能使相互比較的樣本在基因型上一致或比較接近， 以減少非相關帶的檢測。對于培養的細胞而言， 互相比較的細胞應在相同的培養基中培養。高質量的RNA是DDRT-PCR 技術成功的關鍵因素之一。另外， 在進行DDRT-PCR實驗時， 所有的PCR 反應最好都應用同一來源的Taq DNA 聚合酶，因為不同來源的Taq DNA 聚合酶的貯存緩沖液及其在貯存和反應溫度下的活力可能會存在差異， 從而可能會導致DNA 帶型的差異。

3 mRNA 差異顯示技術的優點及缺陷

DDRT-PCR 技術通過對一系列引物的組合利用，能夠在較短的時間內獲得差異顯示基因，該方法具有很多優點，如敏感（可鑒定低豐度的mRNA）、快速、易操作等。然而在實際操作中仍存在一些問題，主要表現為假陽性率高、對高豐度mRNA 具有明顯的傾向性[3]、易引起污染（因為起初的mRNA 差異顯示技術是通過同位素進行放射自顯影顯示差異條帶的圖像的），此外由于某些序列的特異性，一些差異表達的轉錄不能得到分離[4]， 所以凝膠中的單條帶可能由1 種以cDNA 片段所構成。

4 mRNA 差異顯示技術的改進

針對mRNA差異顯示技術存在的問題，人們想到很多新方法來完善這項技術。

4.1 引物的改進

最初的錨定引物為Oligo dT12MN（M=A/C/G； N =A/T/C/G），共12種組合，其工作量很大。Liang等[5]將錨定引物先后改為4種兼并引物（T12MA、T12MT、T12MC、T12MG。M=A/C/G）和單堿基錨定引物T11M （M=A/C/G），減少了工作量，增加了重復性，也提高了分辨率。又將cDNA 分組的數量減少到3 個[6]，并證明使用3 個單堿基錨定Oligo（dT） 引物可以解決與使用雙核苷酸豐余引物相關的大部分問題。隨后也有人用較長的引物，使問題得到進一步改善[7]。

4.2 PCR的改進

Marten 等建議兩步PCR 法，即開始的4個循環為低嚴謹性，后面則采用高嚴謹的PCR 循環，他將此技術稱為EDD（Enhanced diffferential display）。推薦的PCR 參數為：開始3 個低嚴謹循環：第一個循環，94 ℃變性5 min，40 ℃退火5 min，68 ℃延伸 5 min；接著兩個循環：94 ℃變性2 min，40 ℃退火5 min，68 ℃ 延伸5 min；后面的22～25個為高嚴謹的循環： 94℃變性1 min， 60 ℃退火1 min， 68 ℃延伸2 min， 然后68 ℃延伸7 min。經過改進，不僅保持差異帶的特征性，而且顯著地增強了重復性和敏感性。

4.3 提高低拷貝mRNA 的差異顯示率

DDRT-PCR 對高拷貝mRNA 有很強的傾向性。在DDRT-PCR 中模板極多，幾乎所有模板的啟動均有引物錯配，而且dNTPS的濃度極低，因而造成競爭機制，使DDRT-PCR 產物更傾向于高拷貝mRNA ，而對低拷貝檢測較差。cDNA 末端快速擴增法（RACE） 的成功應用解決了這一問題，能從微量mRNA和低豐度轉錄本中克隆全長cDNA，利用這項技術有效地解決了DDRT-PCR中的這一難題[8]。

4.4 應用非放射性同位素

起初mRNA 差異顯示是通過放射性同位素進行放射自顯影顯示差異條帶的圖像，但這種方法易造成污染環境， 對人體有害，并且費時費力。為克服這個缺點，采用了非同位素mRNA 差異顯示，現在這項技術發展很快[9]。有研究者采用熒光素代替同位素對PCR 產物進行標記， 電泳分離后的產物可在DNA 測序儀上讀取，既改善了操作的安全性， 也提高了敏感性和差異顯示的分辨率[10]。

4.5 電泳的改進

非變性凝膠電泳用在差顯技術上，降低了顯示譜帶的復雜性，同時簡化了后期進行克隆篩選的工作。George等[11]用毛細管電泳系統對熒光標記的表達序列標簽進行快速自動化識別， 而且該電泳系統經改造后可用于cDNA 帶的收集。

4. 6 應用反向Northern 印跡雜交

為了排除假陽性的干擾，可以采用反向Northern 印跡雜交來驗證[12，13]。反向Northern 印跡雜交是一種比較節省、快速的方法[14]，可以在一次試驗中檢測出將全部待測的片段。李子銀等[15]通過制備兩個cDNA 探針進行兩輪反Northen 雜交結合質粒酶切圖譜分析，建立一種快速篩選差異陽性cDNA 的方法，獲得的陽性克隆cDNA 可以用作探針獲取全長序列。

5 展望

mRNA差異顯示技術在逐漸完善，因其具有操作簡便、快速，一次能分析多個樣品等優點而給研究帶來了諸多便利， 在多種基因檢測技術中，mRNA 差異顯示技術作為研究細胞、組織在不同條件下基因表達水平差異的重要手段，不僅應用于生物醫學[16，17]也廣泛應用于動物遺傳育種[18-21]、動物營養[22]等領域。經過不斷地改進和完善，它已經成為生物醫學以及農業技術的一個很好的研究工具。

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