蘇中地區豬源多殺性巴氏桿菌的分子流行病學調查

摘要：對來自蘇中地區25個疑似感染多殺性巴氏桿菌的規?；i場隨機采取的250份病料進行了涂片鏡檢、分離純化、生化試驗、菌落熒光檢測、菌體血清型鑒定、PCR鑒定和動物試驗。結果分離出4個豬場共21株多殺性巴氏桿菌，21株多殺性巴氏桿菌中共檢測出3個血清型，其中5型17株，1型3株和3型1株。通過對蘇中地區豬多殺性巴氏桿菌流行情況的初步調查，為豬巴氏桿菌病的快速診斷和科學防治提供了重要依據。

關鍵詞：豬；多殺性巴氏桿菌；分子流行病學；調查；蘇中地區

中圖分類號：S858.28 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）04-0022-03

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是一種重要的病原菌，對多種動物和人均有致病性，常引起豬發生肺炎和萎縮性鼻炎（Atrophic rhinitis，AR），也是豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）的重要致病因子之一[1]。近年來，蘇中地區部分規模化豬場受多殺性巴氏桿菌的侵害呈逐年上升趨勢，尤其是與其他病毒和細菌的混合感染、繼發感染。為此，對本地區豬場多殺性巴氏桿菌的分子流行病學進行調查是十分必要的，可為預防和控制該病在本地區的流行提供重要依據。

1 材料及設備

1.1 檢測病料

2011年8月至2012年12月，從蘇中地區25個疑似感染多殺性巴氏桿菌的規?；i場采取豬耳靜脈血、肺、心血、腦、脾、淋巴結等共250份病料。

1.2 主要試劑材料及儀器設備

1.2.1 主要培養基 血清和鮮血瓊脂平板、鮮血瓊脂斜面、麥康凱瓊脂平板和普通肉湯培養基等，以上培養基均按常規方法制備。

1.2.2 主要試劑 生化試驗的糖或醇；革蘭氏和美藍染液；MR、VP、接觸酶、脲酶等試驗用的試劑；Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker等均購自正規廠家。

1.2.3 主要儀器設備 凝膠成像系統、電泳儀、PCR擴增儀、CO2培養箱、超低溫冰箱、生物顯微鏡等。上述儀器設備均由江蘇省動物流行病學研究中心提供。

1.3 試驗動物

健康綿羊4只、健康小白鼠若干只，由江蘇畜牧獸醫職業技術學院教學動物醫院提供。

2 方法

2.1 病料采取

從蘇中地區25個疑似感染多殺性巴氏桿菌的規?；i場，每個豬場隨機采取10份，共250份疑似病料。生前無菌采取疑似病豬耳靜脈血，死后6 h內剖檢尸體無菌采取新鮮的肺、心血、腦、脾、淋巴結等材料。

2.2 分離鑒定

2.2.1 涂片鏡檢 將上述疑似病料分別按照常規染色法進行革蘭氏染色和美藍染色，然后鏡檢。

2.2.2 分離純化 將鏡檢結果為革蘭氏陰性，且美藍染色為兩極濃染桿菌的疑似病料劃線接種于血清瓊脂平板和綿羊鮮血瓊脂平板，置于CO2培養箱中37 ℃培養24 h后，挑取圓形、透明、直徑1～2 mm的灰白色可疑菌落，抹片革蘭氏染色和美藍染色，顯微鏡下觀察其細菌的形態特點。同時，挑取上述典型菌落劃線接種于綿羊鮮血瓊脂斜面上，進行純培養。取純培養的單個典型菌落進行革蘭氏染色和美藍染色，鏡檢觀察純培養后細菌的形態和染色特點。并將純培養物接種于鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和普通肉湯培養基，37 ℃有氧條件下培養，同時設立另一組在厭氧條件下培養，觀察其生長特性。

2.2.3 生化試驗 將接種分離菌的24 h純培養物，做水楊酸、葡萄糖、果糖、甘露醇、半乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨醇、乳糖、鼠李糖、菊糖、麥芽糖、阿拉伯明膠等糖（醇）發酵試驗。并按常規方法分別進行硫化氫試驗、脲酶試驗、接觸酶試驗、吲哚試驗、MR試驗和VP試驗。

2.2.4 菌落熒光檢測 將純培養物劃線接種于血瓊脂平板上，37 ℃培養24 h后觀察結果。

2.2.5 菌體血清型鑒定 按照相關文獻報道的多殺性巴氏桿菌菌體血清型抗原的常規鑒定方法操作[2]。

2.3 PCR鑒定

將上述純化初步鑒定的細菌進一步用PCR方法確定。用滅菌接種環取少許被檢純培養后菌落與100 μL無菌PBS液混勻，取1 μL菌懸液作PCR模板。按照唐先春等[3]的豬多殺性巴氏桿菌PCR鑒定方法操作。根據巴氏桿菌Kmtl基因（NO.AF016259）序列設計引物，P1：5'-GGTCT-TAGATGAGCGACAAGG-3'，P2： 5'-GCGCTAT-TACTTCCTTCGTTC-3'， 擴增片段大小為457 bp，引物由某正規公司合成。反應體系（50 μL）：10×緩沖液5 μL，2 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶 1 μL，模板1 μL，滅菌ddH2O 40 μL。反應條件：94 ℃變性4 min，94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，回收測序。

2.4 動物試驗

將分離菌純培養物接種于血清肉湯培養基中，37 ℃培養12 h。用生理鹽水將培養懸液稀釋成菌數約為109 CFU/mL，分別腹腔注射5只健康小白鼠，0.2 mL/只，同時設立生理鹽水陰性對照組。在接種后72 h內觀察小白鼠死亡情況，并剖檢小白鼠，觀察其病理變化，且采取小白鼠心血等病料組織涂片，染色鏡檢，并進行細菌分離鑒定。

3 結果

3.1 鏡檢結果

鏡檢可見25個疑似豬場中有4個豬場、250份疑似病料中共有21份存在可疑病菌。鏡下觀察到的細菌為革蘭氏陰性球狀短桿菌，散在或成對存在，美藍染色為兩極濃染的球狀桿菌，有莢膜。

3.2 分離鑒定結果

3.2.1 分離純化鑒定結果 21株疑似病原菌在血清瓊脂平板和鮮血瓊脂平板上均長成邊緣整齊、表面光滑、濕潤、露珠樣的細小菌落，在鮮血瓊脂平板上無溶血現象。對分離菌進行純培養，純培養物為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢，兩極著色不明顯，美藍染色兩極濃染明顯，多數為單個存在。純培養物為需氧或兼性厭氧菌，無運動性。再次接種在鮮血瓊脂平板上，呈現露珠樣的細小菌落，無溶血；在麥康凱瓊脂平板上不生長；在普通肉湯培養基中，液面開始輕度渾濁，4～5 d后液體變得清晰，管底出現粘稠沉淀，振蕩后不渾濁、不分散，表面形成菌環。

3.2.2 生化試驗鑒定結果 24 h后純培養物能發酵葡萄糖、果糖、甘露醇、半乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨醇和麥芽糖，產酸不產氣；不能發酵水楊酸、乳糖、鼠李糖、菊糖和阿拉伯明膠；脲酶試驗、MR試驗和VP試驗均為陰性；硫化氫試驗、接觸酶試驗和吲哚試驗均為陽性。

3.2.3 菌落熒光檢測與血清型鑒定結果 純培養物在血瓊脂平板上37 ℃培養24 h后，菌落450折光于低倍顯微鏡下觀察，可觀察到菌落呈藍綠色帶金光、邊緣狹窄的紅黃熒光。在鑒定的21株多殺性巴氏桿菌中共有3個血清型，其中5型的17株、1型的3株及3型的1株。

3.3 PCR鑒定結果

對以上分離鑒定的可疑菌株再進行PCR鑒定，產物經瓊脂糖凝膠電泳，檢測到的大小均一致，與預期大小高度一致。PCR產物經測序分別與巴氏桿菌Kmtl基因（NO.AF016259）序列同源性在98.31%以上，擴增序列同源性較高，引物也設計合理，可用于病原菌的快速鑒定。結合以上鑒定結果，共鑒定出豬多殺性巴氏桿菌21株，并主要來自肺部。

3.4 動物試驗結果

接種病料的小白鼠均在1 d內全部死亡，生理鹽水陰性對照組的小白鼠全部存活。剖檢死亡小白鼠，可見腹腔液明顯增多，心包和胸腔有不同程度的漿液性纖維素性滲出物，心內外膜、腸黏膜出血，肝、淋巴結腫大。采取死亡小白鼠病料涂片鏡檢，鏡下觀察到的細菌為革蘭氏陰性短桿菌，美藍染色具有明顯的兩極特性，有莢膜。進一步分離鑒定與病豬的結果一致。

4 小結與討論

（1）本試驗于2011年8月至2012年12月從蘇中地區25個疑似感染多殺性巴氏桿菌的規?；i場隨機采取的250份疑似病料，通過分離培養、染色鏡檢、生化試驗、PCR鑒定和動物試驗等方法，共分離出4個豬場21株豬多殺性巴氏桿菌，豬場感染率為16.0%，總分離率為8.4%。這說明豬多殺性巴氏桿菌感染在蘇中地區還比較普遍，流行情況較為嚴重，已經對蘇中地區養豬業構成潛在的威脅，成為養豬業的主要呼吸道疾病之一，因此應引起各養豬場和動物防疫部門的高度重視。同時，豬場的感染率高于總分離率，這是由于目前養殖場還是以抗生素進行豬病防治，并長期、大量使用該類藥物所致，這樣將會導致細菌的抗藥性越來越強，治療效果將會越來越差，應引起重視。

（2）多殺性巴氏桿菌的菌體血清型較多，采用常規分離鑒定方法鑒定出豬多殺性巴氏桿菌的菌體血清型多為1、2和5型[2]。本次試驗在鑒定的21株多殺性巴氏桿菌中共有3個血清型，其中常見的5型有17株，1型的3株和不常見的3型1株，這與相關報道一致。

（3）本試驗在細菌的初步染色鏡檢時發現菌株有莢膜，通過分離培養和純培養，發現莢膜不明顯，且兩極濃染現象也不明顯。在通過動物接種試驗后，再次用試驗動物病料染色中又發現了莢膜，這與有關報道基本一致，多殺性巴氏桿菌的莢膜是主要的毒力因子，強毒株是有莢膜的，弱毒株一般是無莢膜，并且莢膜的形成受到培養物的影響，當培養物中鐵受到限制時，莢膜物質會顯著減少[2]。因此，此次試驗表明分離的細菌具有較強的致病力，說明此時間段蘇中地區部分規?；i場受到較強毒株的感染。在動物試驗中，感染的小白鼠在1 d內全部死亡，也說明分離的巴氏桿菌具有較強的致病力。

（4）多殺性巴氏桿菌在分離鑒定時，其菌落、菌體形態特征與很多細菌相似，如其他溶血巴氏桿菌、嗜肺巴氏桿菌、波氏桿菌、放線桿菌等都為革蘭氏陰性桿菌，都有兩極著色特性[1]。因此，采用常規染色、生化等方法鑒定難度較大。而PCR引物具有很強的靈敏度和特異性，大大降低了分離細菌工作的難度。所以采取PCR鑒定技術結合生化等試驗，可明顯提高多殺性巴氏桿菌的分離鑒定率和準確度，完全適合應用于該病的流行病學調查。

（5）多殺性巴氏桿菌是規?；i場的一種重要病菌，嚴重影響豬群健康及飼料利用率。因此，對蘇中地區部分規?；i場進行多殺性巴氏桿菌的分離鑒定，為該病的快速診斷提供了科學依據。同時，對多殺性巴氏桿菌在蘇中地區的流行情況進行初步調查，更有利于對豬巴氏桿菌病的防治提供科學指導。

參考文獻：

[1] 徐引弟，王治方，朱文豪，等.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定和藥敏試驗[J].中國獸藥雜志，2011，45（5）：5-7.

[2] 李 冰，曲祖乙，趙金梅.豬巴氏桿菌病病原的分離與鑒定[J].中國畜牧獸醫，2008，35（11）：115-117.

[3] 唐先春，吳 斌，索緒峰，等.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及生物學特性研究[J].畜牧獸醫學報，2005，36（6）：590-595.