H5N1禽流感病毒核酸多重RT—PCR檢測方法的建立

摘要：根據禽流感病毒的基質蛋白（M）基因序列和H5亞型禽流感病毒血凝素（HA）基因、神經氨酸酶（NA）基因設計并合成了三對特異性引物，用于建立H5N1禽流感病毒核酸的RT-PCR分型鑒定方法。試驗證明，建立的多重PCR方法可以將H5N1與H6N2、H9N2有效區分。該方法具有較好的靈敏度和特異性，適合在基層動物防疫和監督部門進行H5N1禽流感病毒核酸的檢測。

關鍵詞：禽流感病毒；H5N1；多重RT-PCR；檢測

中圖分類號：S854.43 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）04-0005-03

高致病性禽流感是一種嚴重危害養禽業發展的烈性傳染病，被OIE列為必須通報的傳染病[1]。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，AIV除了可感染禽類外，部分亞型還可感染人、豬、馬等。AIV基因組由包括基質蛋白（M）基因、血凝素（HA）基因和神經氨酸酶（NA）基因在內的8個負鏈單股RNA片斷組成，其中M基因組序列高度保守，HA基因組變異性最強，NA基因組變異次之。HA基因和NA基因某些位點的變異可導致不同的HA亞型和NA亞型[1]，目前發現AIV有16個HA亞型和10個NA亞型，其中H5、H7亞型常表現為高致病性，除了給養禽業帶來嚴重經濟損失外[2]，還可感染人，甚至導致死亡[3]。目前，病毒分離、血清學試驗仍是診斷AI和對AIV進行定型普遍采用的方法，但病毒分離不僅操作繁瑣、復雜和耗時，難以對AI進行快速診斷，還存在潛在散毒的危險。PCR方法是一種基因體外擴增技術，可以在數小時內對某片斷基因擴大數百萬倍。該技術具有特異性強、敏感性高、檢測快速等特點，已廣泛應用于生物學、醫學、獸醫學的各個領域。多重分型PCR是一種特殊PCR形式，其最突出的特點是一次反應可以達到既分型又能夠鑒定亞型的目的，在A、B、C三種流感及其他病源混合感染的鑒別診斷上具有獨特優勢和很高的實用價值[4，5]。根據RT-PCR技術的原理，研究建立了鑒定H5、N1、M1的多重RT-PCR分型技術。

1 材料與方法

1.1 試驗用材料

AIV H5N1抗原，購自哈爾濱維科生物技術開發公司；AIV H6N2、H9N2病毒以及新城疫病毒Lasota疫苗株（NDV）、雞減蛋綜合征病毒（EDSV）和傳染性支氣管炎病毒（IBV），本室留存。

1.2 生化試劑

Ex-Taq E、dNTP （25 mol/L，內含Mg2+）、RNA酶抑制劑、反轉錄酶AMV、10×PCR buffer以及 DNA Marker DL2000 均購自寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取液購自科登生物工程有限公司；0.1% DEPC水由本室自制；二甲基亞砜購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 引物設計及合成

參考基因庫中禽流感病毒M基因、HA基因和NA基因序列，經Clustalx序列軟件比對后，選擇在保守區域用Primer Primer5.0軟件設計了3對引物（表1）上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取

（1）1.5 mL離心管中加入120 μL RNA提取液和120 μL樣品，混勻，室溫放置5 min。

（2）加入120 μL -20℃預冷的氯仿，混勻，室溫放置3 min。

（3）12 000 r/min， 4 ℃離心5 min，取上清120 μL于另一離心管中，加120 μL -20℃預冷異丙醇，室溫放置5 min。

（4）12 000 r/min， 4 ℃離心10 min，棄上清，加入600 μL -20 ℃預冷75%乙醇，上下顛倒，12 000 r/min， 4 ℃離心5 min，棄上清。室溫放置約3 min近干燥。

（5）加20 μL 0.1% DEPC處理過的水溶解沉淀RNA，-20 ℃保存備用。

1.5多重RT-PCR

采用總體積為50 μL的多重PCR反應體系，即10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合液5 μL，40 U/μL的Rnase Inhibitor 1 μL，5 U/μL的Taq E 1 μL，反轉錄酶（AMV）1 μL，二甲基亞砜3 μL，10 pM/μL的 M1、N1、H5基因的上下游引物各0.5 μL，提取的病毒RNA模板1 μL，最后加0.1% DEPC處理過的水補足至50 μL。振蕩離心混勻后，在PCR儀上設定程序進行擴增，通過對反轉錄條件及多重PCR變性、退火、延伸的溫度和時間以及循環次數等的優化，最終確定其反應參數為50 ℃反轉錄30 min，94 ℃預變性2 min后，進入94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循環35次，然后72 ℃延伸8 min，于12 ℃結束多重PCR擴增。

1.6 PCR產物分析

取7 μL多重PCR產物與2 μL Loading Buffer上樣緩沖液混合，在1.5%瓊脂糖凝膠上以100 V電壓進行電泳28 min，然后置數碼凝膠系統觀察拍照，分析記錄結果。

回收、純化229、380、878 bp的cDNA擴增片段，送上海生工生物工程有限公司進行測序，并用DNAStar基因分析軟件分析測序結果。

1.7 H5N1多重RT-PCR 敏感性試驗

用建立的多重RT-PCR 反應體系對10倍系列稀釋的禽流感H5N1抗原進行檢測，檢驗該體系對各稀釋度抗原模板的敏感度。

1.8 委托樣本的檢測

用建立的多重RT-PCR 反應體系對5份已知AIV H9樣本、1份已知AIV H6樣本和360份禽咽肛拭子盲樣進行檢測，與出口檢疫正式采用的熒光RT-PCR檢測方法比較。

2 結果

2.1 多重RT-PCR特異性試驗

經多重RT-PCR擴增，其產物與DNA分子量標準比較，顯示H5N1抗原擴增出380、878、229 bp3條帶，而H6N2、H9N2病毒僅擴增出M1cDNA1條帶，NDV、IBV、EDSV則無條帶呈陰性，與理論預期值一致（圖1）。

2.2H5N1多重RT-PCR敏感性試驗

對禽流感H5抗原做HA試驗，病毒滴度為1：256?？乖謩e做10倍系列稀釋，10-1、10-2、10-3倍抗原稀釋液多重RT-PCR檢測結果陽性；抗原做10-4及以上倍數稀釋，多重RT-PCR檢測結果陰性。敏感度試驗表明，多重RT-PCR 對抗原的最低檢測稀釋度為10-3，是一種較為靈敏的檢測方法（圖2）。

2.3 委托樣本的檢測

5份已知AIV H9樣本、1份已知AIV H6樣本檢測結果顯示，僅擴增出229 bp M1cDNA1條帶，360份禽咽肛拭子樣本則無條帶呈陰性，與熒光RT-PCR 方法檢測結果一致，符合率達100%，說明該多重RT-PCR方法可以用于基層動物防疫和監督部門的檢測。

3 討論

AIV H5亞型不僅感染家禽，引起大批死亡，造成嚴重的經濟損失，還可感染其他動物和人，有重要的公共衛生意義。傳統的病毒分離和血清學試驗無法對流行的AIV亞型進行快速檢測鑒別。本試驗根據AIV 基因易變異的特性及多重分型PCR引物設計原則，參考基因庫中AIV HA基因、NA基因和M基因序列，分別針對H5、N1和M1基因設計了3對特異性引物，其中M1（S，A）是A型流感的通用引物。而H5、N1為分別針對H5、N1亞型的特異性引物，能夠分別特異性地檢測相對應的亞型。利用這3對引物，通過對多重RT-PCR擴增條件的優化，建立了快速檢測鑒定AIV H5亞型的多重RT-PCR分型技術。

該多重RT-PCR分型方法檢測結果顯示，AIV H5N1在380、878、229 bp位置同時出現3條cDNA擴增帶，而H6N2、H9N2病毒僅擴增出M1 cDNA 1條帶，傳染性支氣管炎病毒、新城疫Lasota疫苗株（NDV）和減蛋綜合征病毒則呈陰性。多重RT-PCR 敏感性試驗結果表明，H5N1抗原最低檢測稀釋度為10-3。H5亞型特異性試驗結果表明，僅H5呈陽性，其他H6、H9亞型和NDV、IBV、EDSV均呈陰性。對所擴增片段進行回收、純化并測序，其測序結果經DNAStar基因分析軟件分析，這些片段分別與AIV HA基因、NA基因和M基因有著高度同源性，提示這些擴增基因的序列與原參考序列的基因來源一致，即分別來源于AIV的H5亞型HA基因、NA基因和M基因，表明該多重RT-PCR分型方法具有高度特異性。

同時，該多重RT-PCR分型法不需要進行多次PCR擴增，在數小時內就可完成對AIV H5亞型的快速檢測鑒別，能夠在分型同時一步鑒定到亞型，達到快速診斷和鑒別AIV的雙重目的，對及時有效控制AIV感染有重要意義，對AIV H5亞型感染制定有效的防制措施具有實用價值和指導意義。

參考文獻：

[1] SENNE D A， PANIGRAHY B， kAWAOKA Y， et al. Survey of the hemagglutinin（HA） cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses： amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential[J]. Avian Dis， 1996， 40：425-437.

[2] ALEXANDER D J.A review of avian influenza in different bird species[J]. Vet Microbiol， 2000， 74：3-13.

[3] HIEN T T， LIEM NT， DUNG NT， et al. Avian influenza A（H5N1） in 10 patients in Vietnam[J]. NEngl JMed， 2004， 350：1179-1188.

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[5] 趙建梅， 魏 榮， 王志亮， 等. 一步法多重RT-PCR檢測新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎病毒試驗的研究[J].中國動物檢疫， 2003，20（1）：22-24.