“泰山紅”石榴高頻再生體系構建

摘 要：以“泰山紅”石榴帶芽莖段為外植體，進行了組織培養研究，并建立了高頻再生體系，為今后的遺傳轉化和育種研究奠定基礎。研究結果顯示，最佳初代培養基為MS+1.5 mg/L BA+0.3 mg/L IBA+2 g/L PVP，成芽率達85.7%，成芽個數為4.3。最佳增殖培養基為B5+0.6 mg/L BA+0.5 mg/L IBA+0.3 mg/L AgNO3+0.2 mg/L GA3+100 ml/L 椰汁+2 g/L PVP，增殖系數達5.8。最佳生根培養基為B5+1.0 mg/L IBA+100 ml/L 椰汁，生根率達94.0%，移栽成活率達89.0%。

關鍵詞：石榴；莖段；組織培養；再生體系

中圖分類號：S686.04+3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）03-0011-06

石榴（Punica granatum L.）為石榴科（Punicaceae）石榴屬（Punica L.）多年生落葉樹種，是一種集生態、經濟、社會效益和觀賞價值與保健功能于一身的優良果樹[1，2]。石榴作為果樹和觀賞植物在我國已有2 000 多年的栽培歷史，種質資源極為豐富[3，4]，目前中國石榴栽培面積位居世界第一[5]。 “泰山紅”石榴是山東省果樹研究所1996年選育的優良品種[6]，該品種果型大，汁液多，味極甜，耐貯運，適應性強，商品價值極高[7，8]，不僅是山東的主栽品種之一[9]，也在江蘇、河南、安徽等省大面積栽植。

近年來，石榴的組織培養工作取得了很大進展，涉及的外植體材料包括莖尖[10]、莖段[11，12]、葉片[13]、花藥[14]和胚[15～17]等，初步建立了石榴不同外植體材料的再生體系，并且已經得到了人工種子[18]。與一般園藝植物相比，石榴組織培養中存在著難分化、易褐化[19]、易玻璃化、易落葉[20，21]、增殖系數不高[22]等問題。在前人基礎上，本研究旨在系統解決石榴組培中的上述難題，以“泰山紅”石榴為材料，探索通過莖尖和莖段培養建立完整高頻再生體系的關鍵技術。另外，組織培養技術已不僅是單純滿足工廠化生產的需求，還可實現產量提高和品質改善[23]，更是作為重要基礎和手段向著遺傳轉化[24]、生物技術育種[25]和轉基因工程等方向發展[26～28]。因此，本研究的結果還為“泰山紅”石榴以后的遺傳轉化、多倍體育種和轉基因育種等工作奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以山東省果樹研究所苗圃基地的“泰山紅”石榴為材料，于2011年12月采集成年植株一年生休眠枝條，插入清水中置于室溫和自然光下培養，待芽萌發抽枝長至2～5個節時，取其帶芽莖段作為外植體材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒與初代培養 取新萌發的幼嫩枝條，去掉2/3葉片，剪成1.5 cm左右的帶芽莖段，用洗潔精稀溶液浸泡振蕩洗滌10 min，自來水沖洗干凈后，置于超凈工作臺上滅菌。75%的酒精表面殺菌30 s，無菌水沖洗2遍；5%的NaClO溶液浸泡振蕩8 min，無菌水沖洗5遍；取出莖段剪去兩端變色部分2 mm左右，置于4‰的PVP溶液中浸泡10 min，取出用無菌濾紙吸干并接種于加有不同濃度BA、NAA和IBA的MS初代培養基上（圖版A）。16℃弱光培養10 d后進行正常培養。培養條件為：溫度（24±1）℃，光照強度1 500～2 000 lx，光照時間14 h/d，下同。每個處理20瓶，每瓶接種4個外植體，重復3次。30 d后統計成芽率和成芽數。

1.2.2 增殖培養 當誘導出的腋芽長至2～3 cm 時，從基部切下后轉入MS和B5兩種增殖培養基中，添加BA和IBA并設不同濃度。加入2 g/L PVP防褐變，加入AgNO3促進不定芽的再生，加入GA3防止玻璃化，加入椰汁防莖尖壞死和葉片變黃脫落。做不同封口材料塑料蓋和透氣性膜的比較處理。30 d后觀察記錄增殖系數和長勢。

本研究中，石榴的增殖芽有兩種類型，一種為叢生芽，增殖系數以分出的單株芽計算；另一種為單株芽，其節位上有腋芽萌發，增殖系數以腋芽（大于2 mm）萌發的節位個數計。各處理組合如表1所示。

1.2.3 生根培養和移栽 當增殖芽長到3～5 cm時，從基部切下轉入B5或1/2B5培養基中進行生根培養。加入不同濃度的IBA，采用一步和兩步生根法，并比較處理效果。一步生根法，即首先在加有100 ml/L椰汁和不同濃度IBA的B5或1/2B5培養基中暗培養7 d，然后轉入常規光照培養。二步生根法，即首先接種到附加不同濃度IBA的B5培養基中暗培養7 d，然后轉入加有100 ml/L椰汁且不加任何激素的1/2B5培養基中進行常規光照培養。