槭樹葉片類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因RT—PCR擴增體系優(yōu)化

摘 要：以槭樹“秋天火焰”變色期秋季葉片為試材，采用改良CTAB法提取葉片總RNA，利用GenBank中相關(guān)物種的UFGT基因序列設(shè)計特異引物，進行RT-PCR擴增并對RT-PCR反應(yīng)體系中的引物、退火溫度和循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化，建立了槭樹葉片UFGT基因的RT-PCR擴增反應(yīng)體系。

關(guān)鍵詞：槭樹；UFGT；RT-PCR

中圖分類號：Q781文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）03-0001-04

彩葉樹種的葉色表達是遺傳因素和外部環(huán)境（光照、溫度、水分和礦物質(zhì)營養(yǎng)）共同作用的結(jié)果，二者通過改變樹種葉片中各種色素的種類、含量以及分布形成了多彩的葉片。彩葉樹種葉片呈現(xiàn)彩色的直接原因就是葉片中的色素種類和比例發(fā)生了變化。類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP glucose-flavonoid-3-o-glycosyltranferase，UFGT） 是花青苷合成途徑的最后一個酶，它使不穩(wěn)定的花青素轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的花青苷[1]，并且該酶催化多種花青苷，甚至可以催化黃酮醇的糖苷化。Boss等以黑色果皮的Shiraz葡萄品種的幾種不同組織為試材，檢測花青苷生物合成的幾個相關(guān)基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)只有UFGT基因在果皮上特異表達，而其它的基因在各組織中均有表達；UFGT基因在有色葡萄中表達，而在白葡萄皮中不表達，說明UFGT基因是葡萄皮著色的關(guān)鍵基因[2，3]。

槭樹是重要的秋季色葉樹種，在世界各地園林景觀中廣泛應(yīng)用。目前對其研究主要集中在栽培[4]、酶活性[5]、光合日變化[6，7]等方面，關(guān)于槭樹葉色表達相關(guān)基因克隆方面的研究則較少。本研究以槭樹秋季葉片為試材，對擴增UFGT基因的RT-PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，從而建立起高效特異的槭樹葉片UFGT基因擴增PCR體系。

1 材料與方法1.1 材料

試驗于2011年11月在山東省果樹研究所進行，以槭樹品種“秋天火焰”（Acer×freemanii‘Autumn Blaze’）的秋季變色葉片為試材，采自山東省果樹研究所彩葉樹種種質(zhì)資源圃。于11月份采集葉片，迅速放入液氮中冷凍，帶回實驗室放入-80℃冰箱中備用。1.2 試劑

CTAB、SDS、EDTA、NaCl、PVP、LiCl、DEPC、Tris堿、巰基乙醇、蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素、瓊脂糖、瓊脂粉等為進口分析純試劑；異戊醇、氯仿、無水乙醇等為國產(chǎn)分析純試劑；PCR kit、cDNA kit；PCR引物合成由上海生工生物技術(shù)公司進行。玻璃器皿于180℃烘烤8 h，塑料制品等用0.1% DEPC水浸泡過夜后高壓滅菌。

由于RNA在RNA酶的作用下非常容易降解，RNA 提取中所用的溶液除Tris外，均用0.1% DEPC水處理并高壓滅菌，含Tris的溶液用經(jīng)高壓滅菌的DEPC水直接配制。1.3 RT-PCR體系的建立

1.3.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 總RNA提取參考招雪晴等[8]的方法，采用改良CTAB法提取，將提取到的總RNA用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，采用Nanodrop紫外分光光度計測量OD值。

1.3.2 UFGT基因的引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中（www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）登錄的相關(guān)物種的UFGT基因的保守序列設(shè)計6對簡并引物。

1.3.3 PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化 （1）引物篩選：以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，采用不同的引物進行PCR擴增，以篩選最佳引物。采用25 μl的反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，上下游引物各2 μl，cDNA 2 μl，Taq酶 0.2 μl，滅菌蒸餾水 14.3 μl。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，56℃退火20 s， 72℃延伸20 s，35個循環(huán)；72℃保溫10 min。

（2）最佳退火溫度的確定：反應(yīng)體系不變，采用篩選出的引物，設(shè)置不同的退火溫度（50、51、56、58、60、63、65℃）進行梯度PCR，以確定最佳的退火溫度。

（3）PCR反應(yīng)體系的進一步優(yōu)化：確定了最佳引物和最佳退火溫度后，通過縮短變性時間、減少循環(huán)次數(shù)等措施進一步對得到的PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析2.1 總RNA的制備

利用改良的CTAB法提取槭樹葉片的RNA，如圖1所示，測量其OD值，結(jié)果為2.01，表明蛋白污染少；用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，28S、18S、5S條帶較清晰，沒有降解現(xiàn)象。說明所提取的RNA純度和完整性較好，無DNA污染，符合cDNA合成的要求。

2.3 PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化

2.3.1 最佳篩選引物 對設(shè)計的6對引物進行常規(guī)PCR擴增，篩選最佳的引物序列。由圖2看出，引物1的條帶明顯，適宜進一步做體系優(yōu)化。

1～6：引物1～6擴增條帶；7：內(nèi)參基因Actin

圖2 “秋天火焰”6對引物電泳圖

2.3.2 確定退火溫度 分別設(shè)50、51、56、58、60、63、65℃ 7個退火溫度，將不同退火溫度的PCR 產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測后發(fā)現(xiàn)： 當(dāng)退火溫度為50℃和51℃時出現(xiàn)特異性條帶 （見圖3）。表明50℃和51℃均適合‘秋天火焰’槭樹UFGT基因PCR擴增。

圖3 “秋天火焰”槭樹葉片不同退火溫度的PCR電泳圖

2.3.3 PCR體系優(yōu)化 將PCR反應(yīng)循環(huán)中的變性時間縮短為30 s，循環(huán)次數(shù)改為30次，PCR檢測結(jié)果顯示，可得到UFGT基因片段的特異擴增條帶。此改進措施可使PCR反應(yīng)時間節(jié)省30 min左右，反應(yīng)效率提高。

3 結(jié)論與討論

PCR技術(shù)靈敏度高、特異性強、操作簡便，是現(xiàn)代分子生物學(xué)家必不可少的研究工具。PCR擴增引物的合理設(shè)計與PCR反應(yīng)體系的建立是克隆基因片段或全長序列成功的關(guān)鍵。其中，PCR反應(yīng)體系的組分以及Taq聚合酶、模板cDNA濃度、Mg2+濃度、變性劑等都是重要的影響因素[9]。3.1 反應(yīng)模板

成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA，因而，提取的總RNA質(zhì)量對整個PCR反應(yīng)有重要影響[10]。本試驗中，采用改良CTAB法提取的葉片總RNA質(zhì)量較好，可作為槭樹葉片總RNA提取的常規(guī)方法。3.2 引物

PCR引物設(shè)計的好壞，是能否獲得高質(zhì)量PCR產(chǎn)物的關(guān)鍵。設(shè)計的上游引物和下游引物必須與目的基因片段3′末端高度同源互補[11]。由于在GenBank中無法獲得槭樹UFGT基因的特異性引物，故以GenBank中登錄的梨[12]等UFGT基因為參考，依據(jù)保守區(qū)堿基序列設(shè)計簡并引物，然后進行PCR擴增。由于設(shè)計簡并引物堿基序列的不確定性，引物特異性會有所降低，使PCR擴增的難度加大，反應(yīng)底物濃度以及其它條件都要摸索。最終篩選出引物1適合進行下一步的體系優(yōu)化。

3.3 退火溫度

退火溫度是影響RT-PCR特異性的較重要因素，與引物的長度和G+C 的含量密切相關(guān)[13]。若溫度過高，設(shè)計引物與模板DNA 親和力較小，得不到擴增產(chǎn)物；溫度過低會引起非特異性擴增，因此，一般是在引物Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度，這樣可提高RT-PCR反應(yīng)的特異性。本研究結(jié)果表明，“秋天火焰”槭樹適宜的退火溫度是50℃和51℃。

3.4 循環(huán)次數(shù)

PCR循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度，主要取決于模板DNA的濃度。一般選在30～40次之間，PCR循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物隨之增多。在試驗中，為提高PCR反應(yīng)效率，30個循環(huán)便可達到較理想的擴增效果。

綜上所述，槭樹葉片UFGT基因的最佳PCR體系為：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，上下游引物各2 μl，Taq酶 0.2 μl，cDNA 2 μl，滅菌蒸餾水 14.3 μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，51℃退火20 s，72℃延伸20 s，30個循環(huán)；72℃保溫10 min。

參 考 文 獻：

[1] Lister C E， Lancaster J E.Phenylalanine ammonialyase （PAL） activity and its relationship to anthocyanin and flavoniod levels in New Zealand-grown apple cultivars[J].Journal of the American Society for Horticulture Science， 1996，12（2）： 281-285.

[2] Boss P K，Davies C，Robinson S P.Analysis of the expression anthocyanin pathway genes in developing Vitis vinifera L.cv.Shiraz grape berries and the implications for pathway regulation[J].Plant Physiol.， 1996， 111： 1059-1066.

[3] Boss P K， Davies C， Robinson S P.（下轉(zhuǎn)第6頁）

山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2013，45（3）：4～6Shandong Agricultural Sciences

山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)第45卷第3期方志軍等：玉米器官大小相關(guān)基因SMO2的鑒定和特征分析

收稿日期：2012-09-21