谷子種質資源遺傳多樣性研究

摘 要：利用谷子基因組序列開發出SSR引物205對，其中171對可以穩定擴增出目的條帶，149對有多態性。利用30個多態性SSR標記對41份谷子種質資源進行遺傳多樣性分析，共檢測出291個等位變異，平均每個位點9.7個。谷子地方品種基因多樣性指數平均為0.7907，育成品種基因多樣性指數平均為0.7571。對41個谷子品種進行聚類，在遺傳相似系數為0.164時聚為6組，與生態型基本一致。

關鍵詞：谷子；SSR標記；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號：S515.032文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）03-0033-07

谷子[Setaria italica （L.） Beauv.]起源于我國，是世界上最古老的糧食作物之一[1]。谷子具有耐旱、耐鹽、耐瘠薄、高光合作用效率等特性，在我國北方旱作農業和食品消費多元化需求方面占有重要地位。谷子是二倍體自花授粉作物， 基因組較小，約490 Mb，與水稻基因組結構存在明顯的共線性，是進行基因組研究的理想作物[2]。近年來，基于DNA序列所開發的RFLP、RAPD、AFLP等分子標記的發展為谷子的遺傳研究提供了有力工具[3～5]。SSR標記具有分析簡便、重復性好、多態性高等優點，是谷子遺傳多樣性、品種鑒定和QTL定位等研究的有效標記[6]。然而現有的谷子SSR標記數量少，不能滿足谷子多方面研究的需要，大量開發覆蓋全基因組的SSR標記仍是目前谷子研究的重要工作之一。本研究通過對谷子基因組序列進行SSR位點的搜索，開發出一批SSR標記，對一批不同生態類型的谷子種質資源進行了初步的遺傳多樣性研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從谷子核心種質材料中選取41份有代表性的地方品種和育成品種，共涉及東北平原、華北平原、淮河以南、黃土高原、內蒙古高原及西北內陸6個生態區（表1）。將這些材料發芽培養，兩葉一心期時，采用CTAB法[7]提取DNA。

1.2 SSR標記開發

從數據庫Phytozome下載谷子基因組序列，利用SSRHunter 1.3軟件[8]進行SSR位點的搜索，設置重復次數至少為5、構成重復基元的核苷酸數最多是6個。選取重復次數在20以上或者重復堿基數在40個以上的SSR位點，利用重復序列兩端的保守側翼序列，用Primer 5.0設計引物。引物設計的條件是：PCR產物長度為100～350 bp；退火溫度（Tm）為50～70℃，保證兩引物間Tm值相差不超過4℃；GC（%）含量為40%～65%；引物長度為18～28 bp。為了保證引物的特異性，用于設計引物的保守側翼序列與微衛星位點至少間隔20～30個堿基。引物設計后由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 PCR擴增及等位變異檢測

PCR體系（12.5 μl）包括10×Taq Buffer 1.25 μl，25 mmol/L Mg2+0.75 μl，10 mmol/L dNTP0.3125 μl，上下游引物（5 μmol/L）各1μl，0.5單位Taq酶和DNA模板20～50 ng。PCR程序為：94℃預變性4 min；94℃ 45 s，退火溫度45 s，72℃ 45 s，共35個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.4 遺傳結構和遺傳多樣性分析

根據DNA分子量標準和引物的遷移率記錄結果，遷移率最大（分子量最小）的條帶記為1，遷移率次之的記為2，依次類推，無條帶記為0，建立供試材料SSR基因型信息數據庫。利用PowerMarker V 3.25[9]計算引物的等位基因數（Na）、基因多樣性指數（He）。利用NTSYSpc V 2.10e[10]計算品種間的遺傳相似系數，用UPGMA法進行聚類分析，繪制樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 引物開發

利用Phytozome數據庫提供的谷子基因組序列，共設計出205對引物，其中171對引物能夠擴增出穩定的目的條帶，149對引物表現出多態性。

2.2 遺傳多樣性分析

選取均勻分布在谷子基因組中的30個多態性標記，對41份谷子種質資源進行分析。30對引物共檢測到291個等位變異，每個位點檢測出的等位變異數為4～16個，平均每個位點9.7個。其中，地方品種和育成品種檢測到的等位變異數分別為8.5和6.5個。地方品種基因多樣性指數為0.5728～0.8926，平均為0.7907，育成品種基因多樣性指數為0.5455～0.8750，平均為0.7571，谷子地方品種遺傳多樣性高于育成品種（表2）。分析各生態區資源的遺傳多樣性，發現東北平原品種基因多樣性指數最高，其次是華北平原，淮河以南的最低（表3）。圖1為引物S226在41份谷子品種中檢測到的多態性。

2.3 谷子品種聚類分析

利用NTSYS軟件計算出的41份谷子品種間遺傳相似系數（GS）值變動于0.0328～0.5614之間。其中來自遼寧的紅苗老來變和山東的魯谷5號、河南的繩頭黃谷和張家口的壩低1之間的遺傳相似系數最小，為0.0328，表明它們之間的親緣關系最遠；來自河北的冀谷20和山東的魯谷5號之間的遺傳相似系數最大，為0.5614，說明其親緣關系最近。

對41個谷子品種進行聚類分析（圖2），當遺傳相似系數為0.14時，所有品種可以聚成兩大

組。第一組主要是來自黃土高原、西北內陸和內蒙高原的材料，第二組主要是來自華北平原和東北平原的材料。當遺傳相似系數為0.164時，所有品種可以分成六組：第一組包括黑龍江的老來變和黑谷2號，甘肅的永昌小白谷；第二組包括11個材料，分別是吉林的鴨子嘴、長擴1，河北的鴨子嘴，雁北的早二白谷，張家口的二黃米，山西的腰谷、爬坡糙，陜西的老來變，寧夏的狼尾巴，青海的黃袍谷，新疆的吐魯番谷子，代表了內蒙高原、黃土高原和西北內陸生態區。第三組是四份育成品種，分別是嫩選15、壩低1、隴谷5號和大涼州谷。第四組是山西的紅桿谷、內蒙古的金香玉以及3份育成品種。第五組包括17份材料，其中7份來源于華北平原，3份來源于東北平原，2份來源于淮河以南。第六組為河北的黑谷。聚類分析表明，來自同一生態區的谷子品種基本聚合在一起。

圖2 41份谷子種質資源的聚類分析

3 討論 Jia等（2009）[11]用（GA）n和（CA）n兩個富集文庫開發出269對谷子SSR引物。Li等（2008）[12]建立了 （AC）15、（AT）15、（AG）12、（TG）12和（TC）12 5個微衛星文庫，設計了393對引物。Jia等（2007）[6]從1 213條EST序列中搜索到30個SSR位點，設計出26對引物。本研究直接利用谷子基因組序列開發的SSR引物，可以更全面地反映谷子DNA水平上的遺傳變異。與EST-SSR相比，基因組SSR 引物多態率高，等位變異豐富，可以有效應用于谷子品種鑒定和遺傳多樣性研究。

本研究用30個多態性SSR標記在41份谷子初級核心種質中檢測到291個等位變異，每個位點4～16個，平均9.7個，每個位點的基因多樣性指數在0.6151～0.8977之間，平均為0.8074，表明本研究開發的引物能夠揭示豐富的等位基因變異。此結果與Ma等（2007）[13]的研究結果不一致，與Wang等（2012）[14]的研究結果相似，原因可能是本研究利用的是谷子初級核心種質，選材更具代表性，因此可以全面反映谷子種質資源的多樣性。地方品種和育成品種檢測到的等位變異數分別為8.5個和6.5個，地方品種基因多樣性指數為0.5728～0.8926，平均為0.7907，育成品種基因多樣性指數為0.5455～0.8750，平均為0.7571，谷子地方品種遺傳多樣性高于育成品種。利用NTSYS計算41份谷子品種間的遺傳相似系數，并進行聚類分析，多數材料遺傳相似系數較小，表明我國有豐富的谷子資源類型，有很高的育種潛力。