桂花幼胚的離體培養及生根誘導

2013-01-01 00:00:00馬燕韓瑞超臧德奎郝日明

山東農業科學 2013年3期

摘要：對3個桂花品種大花金桂、籽銀桂、籽丹桂進行幼胚的離體培養，研究了不同消毒時間、基本培養基及生長調節劑組合對離體幼胚萌發的影響，以及不同培養條件和培養基配方對萌發苗生根的影響。結果表明，適合幼胚萌發的適宜培養基，大花金桂為：B5+1 mg/L 6-BA+3 mg/L GA；籽銀桂：B5+2 mg/L 6-BA+2 mg/L GA ；籽丹桂：B5+1.5 mg/L 6-BA+1 mg/L GA 。生根適宜培養基為：1/2 MS+2 mg/L NAA。

關鍵詞：桂花；幼胚；離體培養；萌發；生根

中圖分類號：S685.130.4+.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）03-0007-04

桂花（Osmanthus fragrans）是中國十大傳統名花，其花期正值我國傳統佳節中秋節，花時香聞數里，有“獨占三秋壓群芳”之譽，在庭院綠化和香料生產中一直保持著重要的地位和影響。

桂花在我國的栽培歷史悠久，形成了豐富的品種和類型。大致分為金桂、銀桂、丹桂和四季桂4個品種群，157個品種[1～2]。

桂花種子有后熟作用[7，8]，采收后需要在濕潤條件下保存到第2年才能萌發，在貯藏的過程中腐爛率高達50% 以上，成為桂花育種的限制因素之一。利用組織培養技術可以促進桂花幼胚的提前萌發，但目前研究較少[6，10]，萌發率相對較低。試驗針對不同桂花品種的幼胚進行組織培養，促使幼胚提前萌發并提高萌發率，在短時間內產生大量無菌試管苗，為桂花再生體系的建立奠定了試驗基礎。

1 材料與方法 1.1 材料及外植體處理

試驗材料：取自武漢生長健壯的成年喬木桂花植株。桂花品種：大花金桂、籽銀桂、籽丹桂。

2011年3月初取未完全成熟的桂花果實。去除肉質的外果皮、中果皮，用自來水沖洗1～2 h，在超凈工作臺上剝除內果皮，用75%乙醇浸泡30 s，無菌水漂洗3次，轉入0.1%升汞溶液中消毒，消毒時間分別為 3、5、6、8、10 min，無菌水漂洗3～5次，剝取幼胚接種到誘導培養基上。1.2 幼胚萌發培養

幼胚萌發培養基：MS及B5培養基，添加不同濃度6-BA及GA。每瓶接種幼胚5個，3瓶為1個處理，每處理重復3次。觀察幼胚萌發的動態變化，35天時統計萌發率，進行長勢分析。

1.3 生長調節劑組合對離體幼胚萌發的影響

以B5作為基本培養基，配合不同濃度的6-BA和GA進行2因素4水平的正交試驗設計，共12種組合（表1），篩選大花金桂、籽銀桂、籽丹桂幼胚萌發的適宜培養基。分別在40天時統計萌發率并觀察長勢。

1.4 生根培養

待萌發的幼苗長出2～3對真葉時進行生根誘導。

生根誘導培養基：1/2MS，設置不同濃度NAA。每個組合接種6瓶，每瓶3個材料。

1.5 培養條件培養基pH=5.8，6 g/L瓊脂，30 g/L蔗糖。培養溫度25℃，光照14 h/d，光照強度1 500～2 000 lx。

2 結果與分析2.1 不同消毒時間對幼胚萌發的影響

預試驗過程中，將幼胚接種在3 mg/L 6-BA的B5培養基上，設計了5個消毒時間梯度， 30天時統計幼胚萌發率、褐化率和污染率。結果（表2）表明，0.1%升汞消毒大于3 min，即可達到良好的消毒效果，消毒時間過長（超過5 min），幼胚子葉容易褐化，間接導致材料死亡，從而降低幼胚的萌發率。綜合考慮，升汞消毒時間在3～5 min為最佳。

2.2 不同基本培養基對幼胚萌發的影響

從表3可以看出，兩種基本培養基均可誘導桂花幼胚萌發，當6-BA為1.5 mg/L、無GA添加時，在B5培養基上幼胚的萌發率可高達80%，35天時平均能長出6對真葉，而在MS培養基中，其萌發率僅為55.6%，且誘導苗生長緩慢。綜合考慮萌發率及幼苗的生長勢，誘導桂花幼胚萌發較好的基本培養基為B5。表3還表明，單獨使用6-BA或者GA，均能誘導幼胚萌發，但幼胚培養的萌發率均未超過80%，且幼苗生長較緩慢，真葉較少，長勢不夠好。

2.3 不同生長調節劑對不同品種桂花幼胚萌發的影響

正交試驗結果（圖1、圖2）表明，多種培養基配方均可誘導桂花幼胚萌發，但萌發率與生長勢存在較大差異。在添加2 mg/L GA的培養基上，籽銀桂的萌發率可達到100%，大花金桂和籽丹桂的萌發頻率較低，均未超過80%（圖1）。綜合萌發率、真葉數量、長勢、株高（圖2）等情況，適合不同品種幼胚萌發的培養基為大花金桂：B5+6-BA（1 mg/L）+GA（3 mg/L）；籽銀桂：B5+6-BA（2 mg/L）+GA（2 mg/L）；籽丹桂：B5+6-BA（1.5 mg/L）+GA（1 mg/L）。

2.4 不同生根培養基組合對桂花幼胚萌發苗生根的影響

當無菌苗長出2～3對真葉、株高3 cm時進行生根誘導。對幼苗進行3種處理：保留完整胚根、于根頸處切除胚根、于根頸以下3～4 mm處截斷胚根，轉入生根誘導培養基。結果（表4）顯示，從胚根根頸處切除的材料發根能力遠弱于具備完整胚根或具備部分胚根的材料。試驗中發現具有完整胚根的桂花材料，其主根產生一定量的愈傷組織然后再萌發側根（圖3～6），完全去除胚根的材料其下部會產生大量的愈傷組織，降低生根率（圖3～4）。帶有部分胚根的材料，NAA 濃度為2 mg/L時，生根率最高可達100%，且單株生根數也最多，根較粗壯（圖3～5）。當NAA濃度高于3 mg/L時，根部愈傷化嚴重，且時間長容易褐化，發根能力下降。低于2 mg/L時發根率下降且根生長非常緩慢。因此，1/2MS +NAA （2 mg/L）適合桂花的生根培養。

生根的胚苗在三角瓶中進行煉苗處理，5天后移入腐殖土中，加強管理，成活率可高達70%。

3 討論

3.1 基本培養基

MS與B5基本培養基是植物組織培養中最常用的基本培養基類型。MS培養基含有較高的鉀鹽和硝酸鹽，B5培養基鉀鹽含量較高，但硝酸鹽含量較低。梁茂廠等（2007）[9]認為MS培養基（MS+l～1.5 mg/L 6-BA）有利于桂花幼胚的萌發。近幾年來在一些樹種成功的離體培養中，多數選用MS培養基。袁王俊等[6]以籽銀桂為材料，設置不同基本培養基進行幼胚萌發試驗，認為B5培養基適合桂花幼胚萌發。本試驗綜合考慮幼胚的萌發率和長勢，認為較好的基本培養基為B5，這個結果與袁王俊的試驗一致。可能在幼胚萌發中對鉀鹽的需求量較大，在幼苗的生長過程中，過高的鉀鹽可能有抑制作用。

3.2 不同品種桂花幼胚萌發率及長勢存在差異

圖1、圖2顯示，3個桂花品種間的幼胚萌發率及長勢整體平均差異較大，籽銀桂的萌發率相對較高，大花金桂及籽丹桂的萌發率相對較低。袁王俊等[6]取不同發育時期的胚進行離體培養，發現成功率差異很大：球形期胚及魚雷期的胚基本不能萌發，胚乳硬化后的萌發率達到最高點，認為桂花胚的離體培養應該在胚乳硬化到種子完全

1：2天幼胚； 2：10天變綠的幼胚； 3：30天萌發的幼苗；4～6：生根誘導

成熟前進行。在本試驗過程中，發現雖然在同一時間內取材，但不同品種桂花幼胚的發育時期有著差異，籽丹桂中，幼胚胚乳多處于未硬化階段，其萌發力很弱，容易褐化，幼胚的剝離也比較困難。3個品種的桂花在基因組水平上也可能存在一定的差異，引起幼胚萌發及幼苗長勢的差異。

3.3 6-BA及GA對幼胚萌發的作用

研究表明，一定濃度的GA，能打破種子的休眠，促進種子的萌發，細胞分裂素能促進植物細胞的分裂和分化，試驗中顯示在基本培養基中添加6-BA和GA均可促使桂花幼胚提前萌發。

參考文獻：

[1] 向其柏，劉玉蓮，臧德奎，等.中國桂花品種圖志[M].杭州：浙江科學技術出版社，2008.

[2] 臧德奎，向其柏，劉玉蓮.木犀屬品種分類研究[J].林業科學， 2006， 42（5）：17-21.

[3] 臧德奎，向其柏，劉玉蓮.中國桂花品種分類研究[J].中國園林， 2004，11：40-49.

[4] 楊琴軍，黃燕文，李和平.桂花胚和胚乳發育過程的研究[J].華中農業大學學報， 2003，22（2）：175-178.

[5] 袁王俊.桂花（Osmanthus fragrans Lour.）組織培養的研究[D].開封：河南大學，2005.