鴨疫里默氏桿菌siderophore基因的克隆與表達

摘要：根據鴨疫里默氏桿菌全基因組序列，設計一對特異性引物，擴增了siderophore基因序列，克隆至pGEM-T easy載體后進行序列測定及分析。結果表明，閱讀框架全長為729 bp，編碼243個氨基酸。將該基因克隆到原核表達載體pET-28a后，轉化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG誘導表達，經SDS-PAGE分析結果顯示，已成功表達28 ku的融合蛋白。

關鍵詞：鴨疫里默氏桿菌；siderophore基因；克隆；表達

中圖分類號：S852.61 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）01-0028-03

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一種接觸性傳染性疾病，又稱為鴨傳染性漿膜炎[1]。多見于1～8周齡的雛鴨，呈急性或慢性敗血癥，臨診上主要表現為眼和鼻分泌物增多、喘氣、咳嗽、下痢、共濟失調和頭頸震顫，少數慢性病例出現頭頸歪斜等癥狀，在病變上以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎及部分病例出現關節炎為特征，本病呈世界性流行，是危害養鴨業最為嚴重的傳染病之一[2-4]。為了從根本上提高對鴨疫里默氏桿菌的預防控制水平，必須對鴨疫里默氏桿菌的分子致病機制進行全面深入的研究，對鴨疫里默氏桿菌鐵siderophore基因進行了克隆與表達，為進一步研究載鐵體的免疫與生物學功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鴨疫里默氏桿菌由浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所提供；E.coli JM109、BL21（DE3）感受態細胞、原核表達載體pET-28a（+）購自寶生物（大連）工程有限公司；pGEM-T easy載體購自Promega公司；限制性內切酶及T4 DNA連接酶購自寶生物（大連）工程有限公司。

1.2 鴨疫里默氏桿菌基因組的提取方法

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增結果

2.3 重組原核表達質粒pET-28a-siderophore的構建

3 小結與討論

在自然界中絕大部分鐵要么是以細菌不能利用的化學形態的形式存在，要么是深埋于礦物顆粒中，所以自然界中細菌能夠利用的稱為生物有效鐵是很少的。在進化過程中，許多細菌進化獲得了攝取鐵的能力，大多通過細菌分泌一種叫鐵載體的小分子化合物（結構不同，種類非常繁多）。鐵載體就是大多數微生物合成并輸出的一種螯合鐵的用于攝取鐵元素的低分子復合物[5，6]。它能夠將鐵離子緊緊束縛住，其他微生物就不能再將這些鐵據為己有了。鐵載體還可以幫助細菌將一些深埋于礦物或其他螯合物中的鐵離子拽出來，使得某些病原細菌敢于侵襲宿主細胞，如人體細胞中的鐵離子是與轉移蛋白、血紅蛋白這些組分緊密結合在一起的，但病原菌使用鐵載體奪取這些鐵離子很容易，鐵載體就被稱為這些病原侵犯人體的一把殺手锏。

載鐵體（siderophore）是細菌在低鐵環境中產生的一類低分子有機化合物，它們對鐵有高度的親和力，能與鐵發生特異性的結合反應，是細菌獲鐵系統的重要組成部分，因此載鐵體與許多細菌的致病性密切相關[7]。鴨疫里默氏桿菌能引起1～8周齡小鴨急性或慢性敗血癥，病變上以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎為主要特征，關于它的外膜蛋白A等致病因子已有研究[8]，但載鐵體的研究迄今尚未在國內見相關報道。本研究擴增了鴨疫里默氏桿菌siderophore基因，并成功構建了pET-28a-siderophore原核表達載體，在IPTG的誘導下高效表達了融合蛋白His-siderophore，這一切的研究都足以為開發新的鴨疫里默氏桿菌病診斷抗原或亞單位疫苗奠定堅實的基礎。

參考文獻：

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[8]HuQ，HanX，ZhouX，etal.OmpAisavirulencefactorofRiemerellaanatipestifer[J].VetMicrobiol，2011，150（3）： 278-288.