鋅指核酸酶技術(shù)在動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究中的應(yīng)用

摘要：鋅指蛋白核酸酶（Zinc Finger Nuclease，ZFN）是一種人工合成酶，含有鋅指蛋白和FokⅠ核酸內(nèi)切酶的剪切結(jié)構(gòu)域，因其能特異性識(shí)別并切割DNA序列及其可設(shè)計(jì)性而被用基因定點(diǎn)突變和外源基因定點(diǎn)整合。這項(xiàng)技術(shù)已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中。本文綜述了鋅指核酸酶技術(shù)在轉(zhuǎn)基因研究中的應(yīng)用進(jìn)展，并對(duì)鋅指核酸酶技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：鋅指蛋白； 鋅指核酸酶；基因打靶；同源重組；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

中圖分類號(hào)：Q503文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）02-0135-04

基因打靶主要是依賴同源重組及體細(xì)胞核移植完成對(duì)基因的特定改造，但同源重組及體細(xì)胞核移植的方法概率低、成本高。因此人們嘗試發(fā)現(xiàn)新的基因打靶技術(shù)并應(yīng)用于動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因研究中。鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)的應(yīng)用大大提高了基因定點(diǎn)整合效率。鋅指核酸酶是鋅指蛋白和FokⅠ核酸內(nèi)切酶的剪切結(jié)構(gòu)域組成的融合蛋白，其鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)識(shí)別靶位點(diǎn)，依賴FokⅠ的作用打斷DNA雙鏈，從而造成雙鏈斷裂（Double Strand Break，DSB）。修復(fù)DNA雙鏈斷裂的主要途徑是同源重組，利用ZFN特異斷裂靶基因位點(diǎn)，可提高同源重組效率，故人工設(shè)計(jì)合成的鋅指嵌合核酸酶技術(shù)提供了新的基因打靶平臺(tái)。本文對(duì)鋅指核酸酶技術(shù)研究及其在轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用進(jìn)行了介紹。

1鋅指蛋白

1.1鋅指蛋白及其分類

鋅指結(jié)構(gòu)于1983年首次在非洲爪蟾轉(zhuǎn)錄因子TF ⅢA中被發(fā)現(xiàn)[1，2]。近30年已從不同生物體發(fā)現(xiàn)了十多種鋅指結(jié)構(gòu)，但不同種屬中典型鋅指數(shù)目和相鄰鋅指間連接的長(zhǎng)度有很大不同。鋅指結(jié)構(gòu)是由多個(gè)半光氨酸和（或）組氨酸與鋅離子螯合組成四面體結(jié)構(gòu)。鋅離子的存在是鋅指蛋白發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵，當(dāng)用螯合劑除去鋅離子， 或用 Fe、Cu、Mn、Co、Ni 等金屬離子置換鋅離子后，鋅指蛋白與 DNA等結(jié)合特異性就會(huì)顯著地被抑制，同時(shí)蛋白本身的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也會(huì)被破壞，影響基因表達(dá)[1]。用半胱氨酸或組氨酸代替鋅離子通常也會(huì)導(dǎo)致鋅指功能的喪失。由此可見(jiàn)，鋅指結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性保證了鋅指功能的有效性 。

根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)序列和功能的不同可將鋅指蛋白分為9大類： Cys2His2、Cys8、Cys6、Cys3HisCys4、Cys2HisCys、Cys2HisCys5、Cys4、Cys3His、Cys4HisCys3[3]。Krishna[4]根據(jù)鋅指的空間結(jié)構(gòu)將其分類為： 類C2H2型鋅指、塞結(jié)狀鋅指、高音譜號(hào)鋅指、帶狀鋅指、Zn2/Cys6型鋅指、類TAZ2型鋅指、鋅離子結(jié)合短環(huán)鋅指和金屬硫蛋白鋅指，每一種鋅指都可以在8 組不同的折疊群中找到相應(yīng)的歸類。根據(jù)鋅指蛋白保守結(jié)構(gòu)域的差異可分為C2H2型、C4型和C6型3種類型[5]，其中C2H2型（Cys2His2）為最廣泛的一類。C2H2型鋅指由若干個(gè)重復(fù)單位組成，每個(gè)單位含30個(gè)氨基酸殘基（序列：C2X2242C2X122H 2X3252H，其中C代表半胱氨酸，H代表組氨酸，X代表任何氨基酸）。這些序列在鋅指存在時(shí)折疊形成緊密的ββα結(jié)構(gòu)，其中鋅離子夾疊在α螺旋和兩股反向平行的β鏈中 ，與β鏈末端的2個(gè)半胱氨酸和α螺旋C末端的2 個(gè)組氨酸形成四面體結(jié)構(gòu)。

1.2重組鋅指蛋白及其應(yīng)用

對(duì)含有多個(gè)C2H2型鋅指基序的蛋白來(lái)說(shuō)，在連續(xù)的兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)間存在著高度保守的連接子，保持C2H2鋅指的基本骨架不變，替換鋅指其它位點(diǎn)的氨基酸殘基就可以產(chǎn)生不同序列特異性的鋅指基序[6]，這些基序串聯(lián)在一起就可以形成與DNA序列結(jié)合且具有特定靶向性的鋅指蛋白[7]。鋅指蛋白可以和不同的功能性結(jié)構(gòu)域連接形成具有不同功能的融合蛋白，例如鋅指核酸酶（Zinc Finger Nuclease，ZFN）[8，9]，鋅指轉(zhuǎn)錄激活因子（Zinc Finger Transcription Activators，ZFA）[9～12]，鋅指轉(zhuǎn)錄阻遏因子（Zinc Finger Transcription Repressors，ZFR）[13，14]，鋅指甲基化酶（Zinc Finger Methylases，ZFM）[15]等。可見(jiàn)，人造鋅指蛋白為基因工程研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)平臺(tái)。

2鋅指核酸酶技術(shù)

2.1鋅指核酸酶基本結(jié)構(gòu)

鋅指核酸酶（ZFN）由一個(gè)DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶的剪切結(jié)構(gòu)域融合而成。此酶N末端為鋅指蛋白DNA結(jié)合域，由一系列Cys2-His2鋅指蛋白串聯(lián)組成，每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基。C末端為非特異性核酸酶Fok Ⅰ剪切結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ok Ⅰ是海床黃桿菌（Flavobacterium okeanokoites）表達(dá)的一種限制性內(nèi)切酶，當(dāng)兩個(gè)單體形成二聚體時(shí)才具有活性[16]。

2.2鋅指核酸酶的構(gòu)建及篩選

鋅指蛋白核酸酶技術(shù)已經(jīng)被成功用于動(dòng)植物基因改造實(shí)驗(yàn)中，具有非常高的基因整合效率[17～21]。而在整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中，設(shè)計(jì)特異性的鋅指蛋白（Zinc Finger Protein，ZFP）是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。ZFN識(shí)別結(jié)構(gòu)域的設(shè)計(jì)思路主要有兩種：其一是模塊組裝法 （Modular Assembly）[22]，簡(jiǎn)單地將能夠識(shí)別三個(gè)連續(xù)堿基的鋅指作為一個(gè)“模塊”，再根據(jù)目標(biāo)序列把不同的 “模塊”拼接在一起；另一種是寡聚體庫(kù)工程法[23]，應(yīng)用該方法產(chǎn)生的ZFNs與靶DNA有高度的親和性和特異性。

3鋅指核酸酶在轉(zhuǎn)基因研究中的應(yīng)用3.1鋅指核酸酶介導(dǎo)的基因定點(diǎn)敲除

傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)效率非常低，制約了基因功能及轉(zhuǎn)基因生物等的研究。ZFN技術(shù)為上述研究提供了一種理想的技術(shù)手段。

2001年Bibikova等[24]構(gòu)建了一個(gè)ZFN特異識(shí)別的靶基因質(zhì)粒載體，該載體與表達(dá)ZFN的質(zhì)粒共注入卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ZFN能將靶基因切開(kāi)，并且通過(guò)同源重組修復(fù)了該切口。2002年他們又應(yīng)用ZFN敲除了位于X染色體上的Yellow基因，并發(fā)現(xiàn)變異可穩(wěn)定遺傳給后代[25]，從而證明ZFN可用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究中。

將ZFN mRNA注入到斑馬魚(yú)單細(xì)胞胚胎發(fā)現(xiàn)20%成體的Ntl基因位點(diǎn)發(fā)生了突變并表現(xiàn)出相應(yīng)的突變性狀。研究中，有30%～50%的個(gè)體將ZFN誘導(dǎo)的突變傳給了子代，而7%～18%的子代為突變型[17]。

Meng等[26]將針對(duì)斑馬魚(yú)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體基因設(shè)計(jì)的ZFN mRNA注射入一細(xì)胞期的斑馬魚(yú)胚胎中，導(dǎo)致很高的突變效率，雖然突變存在脫靶現(xiàn)象，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明可以直接注射mRNA到脊椎動(dòng)物胚胎中，實(shí)現(xiàn)基因打靶。

2010年，Watanabe[27]設(shè)計(jì)了針對(duì)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的ZFN，利用ZFN將本身穩(wěn)定表達(dá)EGFP的豬原代成纖維細(xì)胞系中的EGFP敲除，經(jīng)序列和流式細(xì)胞檢測(cè)分析，ZFN誘導(dǎo)的突變包括在ZFN切割位點(diǎn)的堿基替換、敲除或插入，這為轉(zhuǎn)基因豬的產(chǎn)生提供一個(gè)模型[27]。

利用專門(mén)打靶GGTA 1基因編碼半乳糖苷酶轉(zhuǎn)移酶的催化區(qū)域的一對(duì)ZFN，產(chǎn)生出GGTA 1基因敲除的母豬，同時(shí)，將ZFN電轉(zhuǎn)染入雄豬的胚胎成纖維細(xì)胞中，經(jīng)鑒定打靶效率為5.7%，獲得GGTA 1基因敲除的雄豬，說(shuō)明ZFN在雌雄細(xì)胞系中都能工作，為人類疾病的治療提供了一個(gè)模型[28]。

Moreno等[29]針對(duì)腎素設(shè)計(jì)的一對(duì)ZFN，可使第5外顯子上缺失10個(gè)堿基，從而產(chǎn)生移碼突變，產(chǎn)生的Ren-/-的小鼠中無(wú)血漿腎素活性，在腎小球旁細(xì)胞無(wú)腎素蛋白的表達(dá)，與正常小鼠相比，小鼠體重減輕，血壓降低，血尿素氮和血漿肌酐升高等，ZFN技術(shù)為心血管疾病的研究提供各種遺傳背景的模型。

3.2鋅指核酸酶介導(dǎo)的基因定點(diǎn)重組

研究已表明ZFN技術(shù)可顯著提高基因的靶向敲除效率，然而最近研究發(fā)現(xiàn)，ZFN技術(shù)也可以提高同源重組的效率。

Porteus等[30]證明了ZFN可以在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)基因打靶。他們將構(gòu)建好的ZFN特異識(shí)別序列插入到GFP基因中，并將其整合入人胚腎（HEK293）細(xì)胞，建立含有突變型GFP的HEK293穩(wěn)定細(xì)胞系，然后將連接在CMV啟動(dòng)子上的ZFN表達(dá)質(zhì)粒和表達(dá)野生型GFP的同源供體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染該穩(wěn)定細(xì)胞系。結(jié)果顯示，部分細(xì)胞的突變GFP基因得到修復(fù)，轉(zhuǎn)變?yōu)镚FP正常表達(dá)的細(xì)胞。

將針對(duì)人內(nèi)源基因IL2Rγ設(shè)計(jì)的帶4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的ZFN和IL2Rγ同源打靶載體共轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)20%的細(xì)胞發(fā)生了同源重組。Urnov在mRNA和蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證了此結(jié)果[31]。

Erica等[32]利用ZFN將編碼四個(gè)氨基酸的標(biāo)簽序列、GFP表達(dá)框、帶有poly（A）尾巴的GFP表達(dá)框和帶有啟動(dòng)子的GFP表達(dá)框在ZFNs介導(dǎo)下分別整合入K562細(xì)胞中的IL2Rγ基因，效率分別為15%、6%、3%和6%。可見(jiàn)，ZFN可以在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞上顯著提高基因打靶效率，這為基因的定點(diǎn)整合和誘導(dǎo)突變提供了一個(gè)非常有力的工具。

2010年，Melanie等[33]針對(duì)小鼠Rosa26基因設(shè)計(jì)了一對(duì)ZFN，并且將構(gòu)建的潮霉素基因同源打靶載體、β-半乳糖苷酶及Venus同源打靶載體，分別和ZFN的mRNA共同注射入小鼠原核胚胎，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)鑒定同源打靶效率為1.7%～4.5%[33]。

4結(jié)語(yǔ)或展望

研究發(fā)現(xiàn)，ZFN技術(shù)能夠快速有效地在細(xì)胞水平或者個(gè)體水平上進(jìn)行基因敲除和基因插入的操作，為尚未獲得ES細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因物種提供了基因操作的可能性。然而ZFN技術(shù)也存在一些不足，研究證實(shí)ZFN在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后具有毒性及副作用[25]，還需要更深入地研究并解決相關(guān)問(wèn)題。ZFN作為新興的基因打靶的有力工具，存在著巨大的潛力和價(jià)值，通過(guò)研究人員的不斷努力和探索，ZFN技術(shù)會(huì)越來(lái)越完善，并推動(dòng)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。參考文獻(xiàn)：

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