馬鈴薯抗晚疫病基因研究進展

摘要：馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯的第一大病害。利用分子生物學和基因工程技術，從馬鈴薯野生種質資源中分離抗病基因，并將其轉化到優良栽培品種中，是提高馬鈴薯晚疫病抗性高效快捷的方法之一，目前已有多個來自不同野生種質資源中的晚疫病抗性基因被分離或定位。本文主要概述了近年來馬鈴薯抗晚疫病基因的研究現狀。

關鍵詞：馬鈴薯；晚疫病；抗性基因

中圖分類號：S43532文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0141-04

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的馬鈴薯第一大毀滅性病害，可引起馬鈴薯大規模減產。19世紀中葉晚疫病的發生導致了舉世聞名的愛爾蘭大饑荒[1]（The Great Irish Famine），致使數百萬人死亡或流離失所。該病在世界范圍內廣泛傳播，每年在全球造成損失約170億美元，我國的減產損失也在10億美元以上[2]。在發展中國家，每年用于治理晚疫病的花費高達35億美元。

導致晚疫病的致病疫霉菌是一種高度可變的病菌[3]，晚疫病菌群體中出現的A2交配型和原來的A1交配型在大田條件下即可進行有性雜交并產生可以越冬的卵孢子[4]，進一步增加了該病原的變異性和危害性；全基因組測序發現，晚疫病菌的基因組容量高達240 Mb，是迄今發現的囊泡藻界（Chromalveolata）中最大、最復雜的基因組[5]，被認為是進化潛力最高、風險最大、最易克服單個抗病基因或少數幾個抗病基因累加系的病原之一。因此，防治馬鈴薯晚疫病仍是當前馬鈴薯生產和育種的重中之重。

馬鈴薯晚疫病的化學防治主要是應用抗真菌劑[6，7]，但成本高、易導致環境污染。隨著現代分子生物學和基因工程技術的發展，從馬鈴薯抗晚疫病野生種質資源中分離抗病基因，并進行基因轉化導入栽培種中，已經成為馬鈴薯抗病育種的一個重要途徑[8]。本文將對馬鈴薯野生種中抗晚疫病基因的分離、定位及應用進行概述。

1馬鈴薯晚疫病抗性基因定位與分離

11來源于S demissum的晚疫病抗性基因

來自于墨西哥的六倍體野生種S demissum不僅高抗晚疫病，而且易與四倍體栽培品種S tuberosum雜交，是馬鈴薯晚疫病抗性基因的重要來源。目前，已從該野生種鑒定出11個主效抗病基因（R1～R11）并導入到栽培種中。

111R1基因Leonards-Schippers 等（1994）[9]將R1基因定位在S demissum的第Ⅴ號染色體上，R1位點區域也是各種病原體抗病基因的集中區。研究發現，馬鈴薯第Ⅴ號染色體上RFLP標記GP21和GP179之間的短臂區域編碼對P infestans的抗性，這個區域包含多個與馬鈴薯晚疫病抗性相關的數量性狀位點（QTL），這些抗病基因的成簇分布表明它們可能是通過基因復制從同一祖先演化而來的，在此過程中同時也伴隨著功能分化。

2002年，Ballvora 等[10]構建了R1基因位點區域的高分辨率圖譜，并通過圖位克隆結合候選基因方法克隆了該基因。R1包含1 293個氨基酸，相對分子量1494 kD，蛋白結構分析表明，R1包含一個保守的核苷酸結合位點（NBS）、一個富亮氨酸重復序列（LRR）和一個亮氨酸拉鏈結構（LZ）。

2005年，Kuang 等[11]在R1基因位點附近構建了3個大約1 Mb的物理圖譜，鑒定出3個不同抗性的基因家族，其中之一與R1基因高度同源，另外2個與番茄Prf基因和Bs-4基因同源。對R1同源基因的序列分析表明它們在距離進化樹上形成3個明顯的進化枝，在R1同源基因的進化枝上有頻繁的序列交換。這些結果表明R1同源基因包括3組不同的抗病基因，并且由于組內成員頻繁的序列交換而使這些基因具有特定的嵌合體結構，屬于Ⅰ型R基因，該發現也表明Ⅰ型和Ⅱ型R基因可能具有相同的分化機制。

112R2和R2-like基因Li等（1998）[12]利用四倍體作圖群體EJ96-4061將R2基因定位在馬鈴薯第Ⅳ號染色體上，并利用集群分析（BSA）法獲得了與R2位點緊密連鎖的11個AFLP標記。Park等（2005）[13]進一步利用二倍體作圖群體發現了與R2連鎖的2個基因：R2-like和一個未知基因，并獲得了R2-like位點的55個AFLP標記，利用R2-like位點的2個側翼標記對1 586個后代分離群體進行篩選，獲得了該區間的103個重組體，成功構建了R2-like位點的高分辨率遺傳圖譜，并將R2-like定位于馬鈴薯第Ⅳ號染色體的04 cM區域內，同時獲得了與R2-like基因共分離的4個AFLP標記。

Lokossou等（2009）[14]利用R2-like位點和Rpi-blb3位點區域的高分辨率遺傳圖譜，結合等位基因發掘的策略克隆了R2和R2-like， R2和R2-like均無內含子，屬于LZ-NBS-LRR型基因，R2和R2-like編碼的LRR區高度同源，R2的LRR區比R2-like多了一段LRR2和LRR3間的氨基酸插入。

113R3基因位點馬鈴薯抗晚疫病主效位點（Major late blight resistance complex，MLB）的R3單倍型有3個抗病基因簇，其中2個基因簇中的基因具有抗病功能，分別是R3a和R3b[15]，這2個基因之間遺傳距離為04 cM，且具有不同的抗病特性。進一步研究發現，馬鈴薯MLB的R3位點和番茄的抗枯萎病位點I2具有共線性，都位于Ⅺ號染色體的末端，同屬于復合抗病基因位點，且R3位點的3個基因簇中的40個抗病基因類似物都屬于CC-NBS-LRR類型。

① R3a基因：R3a與I2結構相似，其核苷酸和氨基酸序列分別有88%和83%的一致性，R3a基因編碼區長度3 849 bp，編碼一個由1 282個氨基酸組成的多肽，相對分子量1459 kD，特異識別無毒基因Avr3a，符合典型的基因對基因學說[16]。在R3a位點的復雜基因簇內，至少含有3個能夠表達的同源序列：I2GA1、I2GA3和I2GA4，利用重疊延伸PCR將R3a與同源序列I2GA1的CC、NBS、LRR三個結構域互換，發現R3a的表達量和特異識別Avr3a誘導產生HR反應的速度在兩者間無明顯差別，并且R3a特異識別Avr3a的關鍵序列位于LRR結構域內[17]。

②R3b基因：R3b是R3a的姊妹基因，位于馬鈴薯第Ⅺ號染色體的短臂上，二者相距04 cM，具有不同的抗病特性，該基因于2011年被克隆出來[18]，序列分析表明，R3b基因不含內含子，由一個完整的ORF組成，包含3 855 bp，編碼1 284個氨基酸，與R3a具有82%的核苷酸序列一致性和73%的氨基酸序列一致性，同屬于CC-NBS-LRR型抗病基因。進一步對R3a和R3b的LRR結構域分析表明，R3a基因編碼29個LRRs，而R3b基因只編碼28個LRRs，且這2個基因還各自編碼2個各自特有的LRRs。

利用抗病基因和病原效應子共注射煙草發現，R3b基因特異識別其相應的無毒基因Avr3b，但不能識別無毒因子Avr3a，R3a基因也不能識別Avr3b，二者具有不同的識別特異性。這也是繼在馬鈴薯第Ⅳ號染色體上發現Rpi-mcd1和Rpi-blb3基因后，發現的同一個抗病位點上存在兩個功能性抗病基因（R3b和R3a）的另一個范例。

114R8基因晚疫病抗性基因R8是主效單基因，位于第Ⅸ號染色體長臂末端[19]，該區域至少存在3個抗性基因簇。同時，Jo 等（2011）[19]還開發了R8側翼近端粒區的2個標記CDPSw54和CDPSw55（與R8的遺傳距離為1 cM）和遠端粒區3個標記CDPTm21-1、CDPTm21-2和CDPTm22（與R8最近的遺傳距離為2 cM），并獲得了與R8共分離標記CDPHero3，這為分子標記輔助育種和R8的圖位克隆奠定了基礎。

115R10基因馬鈴薯抗晚疫病基因R10位于第Ⅺ號染色體的短臂末端，與已克隆的R3a基因同屬于抗晚疫病主效位點的單倍型，徐建飛等（2008）[20]利用比較基因組學結合BSA分析方法構建了R10位點的高分辨率遺傳圖譜，并將R10定位于標記656T和1001T之間的026 cM區域內。

116R11基因R11為主效單基因，在四倍體馬鈴薯MaR11中以單拷貝形式存在，利用比較作圖和BSA分析將R11定位在第Ⅺ號染色體上[21]，與最近的標記C2_At5g59960距離約為24 cM，R11基因較R3b基因和R10基因更靠近端粒區。

12來源于野生種S bulbocastanum的晚疫病抗性基因

起源于墨西哥和危地馬拉地區的二倍體馬鈴薯S bulbocastanum是一種對晚疫病具有廣譜抗性的野生種，因此來源于S bulbocastanum的R基因對晩疫病菌有著相對廣譜且持久的抗性。目前，已從該野生種中克隆了多個抗晚疫病基因，這些R基因均具有不同程度的廣譜抗病性。

121Rpi-blb1（RB）基因Rpi-blb1（RB）基因位于S bulbocastanum的第Ⅷ號染色體上[22，23]，基因全長3 319 bp，其5′端和3′端分別有130 bp和276 bp的非編碼區，包含一個679 bp的內含子，編碼970個氨基酸的多肽，相對分子量1103 kD。與其它已知的R蛋白比較發現，Rpi-blb1（RB）編碼蛋白與番茄I2蛋白親緣關系更為接近。進一步研究發現，Rpi-blb1（RB）基因LRR區域的異義突變率與同義突變率的比值（Ka/Ks）小于1，表明Rpi-blb1（RB）可能受到純化選擇作用；LRR區域整體同義突變率（Ks）較高，表明這是個相當古老的基因[24]。

Rpi-blb1（RB）所在區域是一個抗病基因簇，包含Rpi-blb1（RB）在內的4個CC-NBS-LRR型抗性基因，這4個基因高度同源，其中Rpi-blb1（RB）編碼21個LRRs，其它3個基因均編碼22個LRRs，并且存在點突變或移碼突變，可能是假基因。

122Rpi-blb2基因Rpi-blb2基因來源于一個四倍體回交群體ABPT，位于第Ⅵ號染色體上與番茄的Mi-1基因位點相同的區域[25]。對跨越Rpi-blb2位點的ABPT來源的BAC克隆和S bulbocastanum來源的BAC克隆比較分析表明，Rpi-blb2位點至少包含15個Mi-1基因的同源基因，序列分析表明Rpi-blb2和番茄Mi-1基因的編碼區有897%的核苷酸序列一致性和82%的氨基酸序列一致性。相對于Mi-1位點，Rpi-blb2位點跨度更大，這表明染色體重組或非對等交換（unequal crossing）在Rpi-blb2位點的進化中發揮了巨大作用。

對Rpi-blb2的LRR區域多態性和進化分析發現，該區域在核酸水平上變異程度很高，而且存在多個突變熱點，通過對該區域的Ka/Ks值估算，發現Rpi-blb2的LRR區總體上受到純化選擇，功能保守，但LRR區不同部位所受到的選擇壓力卻不相同。同時，在核酸水平上，Rpi-blb2基因的LRR區域在馬鈴薯栽培品種和馬鈴薯野生種之間沒有發現明顯的分化[26]。

123Rpi-blb3基因Park等（2005）[27]通過繪制Rpi-blb3位點區域的高分辨率遺傳圖譜，將Rpi-blb3基因定位在第Ⅳ號染色體上093 cM區域內，并利用與Rpi-blb3連鎖的標記開發了第Ⅳ號染色體上另外3個晚疫病抗性位點：Rpi-abpt，R2和R2-like。

Lokossou等（2009）[14]圖位克隆并分析了Rpi-blb3、Rpi-abpt、R2和R2-like，這4個基因均無內含子，屬同一基因家族，是典型的LZ-NBS-LRR型基因，編碼區ORF長2 538～2 544 bp，編碼845～847個氨基酸，與擬南芥RPP13氨基酸序列一致性為349%。Rpi-blb3、Rpi-abpt、R2和R2-like編碼的LRR區高度同源，其中Rpi-abpt的LRR區和R2完全相同。

13來源于其它野生種的晚疫病抗性基因

131來源于S berthaultii 的Rpi-ber1和Rpi-ber2Rauscher 等（2006）[28]將Rpi-ber基因定位在第Ⅹ號染色體上，位于標記CT240和TG63之間的39 cM區域內，并發現Rpi-ber與抗晚疫病基因R1～R11具有不同的抗性。Park等（2009）[29]從兩個不同來源的S berthaultii中發現了抗晚疫病基因Rpi-ber1和Rpi-ber2，這2個基因位于Ⅹ號染色體的長臂上，并且緊密連鎖。Rpi-ber1基因位于標記CT214和標記TG63之間，而Rpi-ber2基因位于這2個標記的下游，連鎖標記的多態性表明Rpi-ber1和Rpi-ber2可能來自于不同的單倍型，但根據上述3個基因的位點和來源推測，Rpi-ber和Rpi-ber1可能是同一個基因。

132來源于S venturii 的Rpi-vnt11和Rpi-vnt13Rpi-vnt11和Rpi-vnt13被定位在S venturii第Ⅸ號染色體上[30]，均屬于CC-NBS-LRR型基因，分別編碼891個和905個氨基酸的多肽，Rpi-vnt11和Rpi-vnt13與番茄花葉病毒抗性蛋白Tm-22具有75%的氨基酸序列一致性，并且Rpi-vnt11和Rpi-vnt13基因編碼的LRR區域僅有2個氨基酸不同，而Rpi-vnt13在其N端有14個氨基酸插入。盡管Rpi-vnt11和Rpi-vnt13結構有所不同，但具有相同的廣譜抗性。

133來源于S ruiz-ceballosii 的Rpi-rzc1Rpi-rzc1被定位在第Ⅹ號染色體上，距離TG403標記104 cM的區域內[31]，根據已知染色體位點的1 603個DArT標記和48個特異性PCR標記構建了總長1 2048 cM的遺傳連鎖圖譜。研究發現Rpi-rzc1基因和與其相距34 cM的F位點編碼紫色花色的基因緊密連鎖，這一發現為從雜交后代選擇含有Rpi-rzc1基因的抗性個體提供了依據。

134其它抗性基因為了獲得馬鈴薯對晚疫病的持久抗性，研究者從其它野生種中鑒定出了更多的抗性基因：Rpi-moc1基因（S mochiquense）[32]，Rpi1基因（S pinnatisectum）[33]，Rpi-mcd1基因（S microdontum）[34]，Rpi-phu1基因（S phureja）[35]，Rpi-dlc1基因（S dulcamara）[36]，這些非小種專化抗性基因的發現為馬鈴薯抗晚疫病育種提供了更為豐富的基因資源。

2馬鈴薯抗晚疫病基因的應用

馬鈴薯是同源四倍體作物，基因組高度雜合，常規育種過程復雜、耗時長且存在連鎖累贅，所以從抗晚疫病的野生種質資源中分離抗病基因并導入栽培品種中，是防治馬鈴薯晚疫病的有效方法。最初，育種學家將野生種S demissum中的主效抗病基因（R1～R11）導入到栽培品種Stuberosum中，但是晚疫病菌小種變異極快，這些主效抗病基因的抗病性很快被克服。因此，研究者們開始利用其它非小種專化抗性的廣譜抗性基因或多個抗性基因的疊加來實現馬鈴薯抗晚疫病的持久抗性。其中，廣譜抗性基因RB（ Rpi-blb1）是應用最為廣泛的基因之一，將RB通過農桿菌介導法導入栽培品種S tuberosum中[37]，轉基因植株獲得了對晚疫病的持久抗性，田間試驗表明RB基因的導入不僅使轉基因植株獲得了持久抗性，而且對馬鈴薯塊莖的大小和產量均無影響。

將多個晚疫病抗性基因（R基因）同時導入易感栽培品種中，利用R基因堆疊（R gene stacking）可延遲晚疫病發病[38]。馬鈴薯Sarpo Mira是通過常規育種獲得的具有水平抗性的栽培品種，研究發現Sarpo Mira中至少包含5個R基因堆疊[39]。通過田間試驗和離體葉片檢測發現，馬鈴薯抗性鑒別寄主MaR8和MaR9也具有廣譜抗性[40]， MaR8至少含有4個抗性基因：R3a、R3b、R4、R8，MaR9至少含有7個抗性基因：R1、Rpi-abpt1、R3a、R3b、R4、R8、R9。多基因堆疊擴大了寄主識別晚疫病菌的范圍，在田間試驗中，多基因堆疊明顯延遲了晚疫病的傳播和發展；值得注意的是，只含有R8基因的植株推遲效果更顯著。最近，Rpi-sto1（S stoloniferum）、Rpi-vnt11（S venturii）、Rpi-blb3（S bulbocastanum）這3個廣譜抗性基因被導入到易感品種Desiree中[41]，離體葉片檢測表明，轉基因植株獲得了抗病功能，其抗性范圍是這3個基因單個抗性范圍的疊加，且沒有基因沉默和其它不利影響。

3展望

馬鈴薯抗晚疫病育種已有100多年的歷史，抗晚疫病基因的獲得對了解野生群體晚疫病的抗性機制和提高馬鈴薯抗病育種效率具有重要意義；也為利用已克隆的抗病基因、研究R基因與晚疫病菌互作的分子機制、探索植物抗病機理提供了重要參考。晚疫病菌[8]和馬鈴薯單倍體[42]的全基因組測序已經完成，人們獲得了馬鈴薯單倍體和晚疫病菌基因組的完整信息，在未來馬鈴薯晚疫病的防治中基本達到了“知己知彼”。 馬鈴薯栽培種為同源四倍體，單倍型之間差異較大，仍有3套基因組尚待完成，正如2011年7月10日的《New Scientist》上有篇題為“One potato genome unravelled， three to go”的評論，提示馬鈴薯基因組研究還有很長的路要走。隨著現代分子生物學研究的不斷深入、測序技術的改進及轉基因體系和相關理論的逐步完善，將會有大量抗晚疫病基因得以定位和克隆，為利用多基因疊加（R gene stacking）及田間抗病基因多態性（polyculture）有效防治馬鈴薯晚疫病及進行馬鈴薯抗晚疫病育種等提供重要基因資源，也為真正實現分子育種開辟新的途徑。參考文獻：

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