小麥TaLTR基因的克隆及初步表達(dá)分析

摘要：以小麥山融3號為試驗材料，克隆了TaLTR cDNA序列（Low temperature-responsive RNA-binding protein）。序列分析表明，TaLTR序列包含完整的ORF區(qū)，編碼蛋白含有162個氨基酸，其氨基端包含一個RRM（RNA recognition domain）超家族保守的結(jié)構(gòu)域，羧基端則富含甘氨酸；經(jīng)半定量RT-PCR分析，表明TaLTR參與低溫、干旱、鹽脅迫逆境反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：小麥；TaLTR基因；RT-PCR；逆境脅迫

中圖分類號：Q785文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0025-05

小麥?zhǔn)羌s35%世界人口的主要糧食，其種植面積約占谷類作物種植總面積的三分之一。低溫、干旱是影響小麥生產(chǎn)的主要非生物脅迫因子，研究小麥對干旱、低溫等脅迫的響應(yīng)機制，發(fā)掘逆境應(yīng)答相關(guān)蛋白基因，對于研究小麥抗逆分子機制及增強抗逆性具有重要的理論和實踐意義。

非生物逆境脅迫下，涉及離子轉(zhuǎn)運與平衡、細(xì)胞生長和分裂、細(xì)胞防御和解毒、能量產(chǎn)生與運輸以及滲透調(diào)節(jié)等生理代謝的大量基因的表達(dá)都會發(fā)生變化[1]。為此，山東大學(xué)夏光敏實驗室利用SSH、基因芯片及雙向電泳-質(zhì)譜分析等方法，對耐鹽抗旱小麥新品種山融3號鹽或干旱脅迫前后的表達(dá)譜進行了分析，獲得了大量表達(dá)模式發(fā)生變化的基因或ESTs信息[2～4]。本研究從山融3號鹽脅迫前后的表達(dá)譜芯片結(jié)果中選取1個表達(dá)變化的EST（EST ID：WL403），對其進行了基因克隆、初步表達(dá)分析。

1材料與方法

11實驗材料

111材料小麥（Triticum aestivum L）品種山融3號，由山東大學(xué)夏光敏實驗室提供；菌株：大腸桿菌（Escherichia coil） DH5α（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

112試劑Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；常用內(nèi)切酶、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit為Fermentas公司產(chǎn)品；Taq酶使用寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品Mighty Amp DNA Polymerase （hot start）；pEASY-T3載體為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

12方法

121總RNA提取和cDNA合成Trizol法提取各取樣時間點的小麥總RNA。根據(jù)Fermentas的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit使用說明，反轉(zhuǎn)錄合成小麥cDNA的第一條鏈。

122TaLTR基因的全長cDNA克隆分析小麥基因芯片和雙向電泳結(jié)果，篩選小麥EST數(shù)據(jù)庫，從對應(yīng)ESTs中選擇克隆一個鹽脅迫下表達(dá)發(fā)生變化的基因。根據(jù)EST文庫中拼接高度同源的ESTs序列，設(shè)計特異性引物TaLOW-S1/A1，擴增獲得153 bp的小片段（TaLOW-S1：5′-TTAGGGTTTAGTAGTAGCGGGG-3′；TaLOW -A1：5′-GTCAGTGATGATCTTGGAGTCG-3′），經(jīng)5′-和3′-RACE擴增，拼接后獲得556 bp cDNA序列。利用ORF finder 程序（http：//wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml）預(yù)測拼接序列的開放閱讀框（ORF）。

使用Primer Premier 50 軟件在預(yù)測的開放閱讀框兩側(cè)設(shè)計特異引物TaLTR-F1/R1，得到一對能有效擴增TaLTR的引物（TaLTR-F1：5′-GAATGGCGGACGTCGAGT-3′；TaLTR -R1：5′-ATCGGGTAACTAGGATAACTGG-3′），以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增，測序。

PCR程序為：98℃ 5 min；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，32循環(huán)；72℃ 10 min；16℃保存。

123TaLTR序列分析利用網(wǎng)站資源對TaLTR基因進行序列分析。NCBI進行nBLAST同源性比對；使用http：//auexpasyorg/ tools/dnahtml翻譯TaLTR氨基酸序列；以InterPro Scan為工具分析蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)域；運用MEGA31軟件構(gòu)建TaLTR基因編碼蛋白的同源系統(tǒng)進化樹；運用DNAMAN、clustalX軟件構(gòu)建多重序列比對圖譜。

124基于半定量RT-PCR的初步表達(dá)分析挑選生長至兩葉一心、健壯的山融3號小麥進行如下脅迫處理：200 mmol/L NaCl泡根處理72 h，然后恢復(fù)72 h；18% PEG 6000浸根處理72 h，隨后恢復(fù)72 h；對照為正常條件下同期生長的健康植株。分別在0、05、1、2、6、12、24、48、72 h恢復(fù)48 h和恢復(fù)72 h取樣，液氮冷凍后-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取山融3號小麥植株脅迫處理不同時間點的根和葉，Trizol法提取RNA并進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，以TaActin-S（5′-AGCCATACCGTGCCAATC-3′）和TaActin-A（5′-AGAGCCTCCAATCCAGAC-3′）作為擴增引物，獲得558 bp左右的Actin內(nèi)參產(chǎn)物片段。以TaLTR-S1、TaLTR-A1作為擴增引物，獲得153 bp左右目的基因產(chǎn)物。Actin基因PCR程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。以Actin基因獲得的cDNA模板量和循環(huán)次數(shù)、最佳擴增程序獲得單一的TaLTR目的產(chǎn)物帶。PCR條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。

2結(jié)果與分析

21TaLTR基因的cDNA克隆

根據(jù)小麥EST WL403序列在NCBI中搜索與其同源的小麥ESTs序列，共獲得321條序列。將這321條序列和5′-、3′-RACE擴增序列進行拼接獲得1個長度為689 bp的contig。進一步設(shè)計特異性引物TaLTR-F1和TaLTR-R1擴增包括完整ORF的cDNA序列，得到約556 bp的產(chǎn)物（圖1），命名為TaLTR（GI：Kc408381）。回收目標(biāo)擴增產(chǎn)物克隆到pEASY-T3載體中，對重組質(zhì)粒進行酶切驗證（圖2）和序列測定，測序結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列見圖3。

22TaLTR基因的序列分析和同源性比較

對獲得的556 bp cDNA序列初步分析表明，該序列包含完整的ORF區(qū)，預(yù)測編碼的蛋白含有162個氨基酸。運用ExPasy、InterPro網(wǎng)站進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能位點預(yù)測，結(jié)果顯示，TaLTR基因編碼的蛋白氨基端包含一個RRM（RNA recognition motif domain）超家族保守的結(jié)構(gòu)域，羧基端則富含甘氨酸（圖4）。

將TaLTR基因推導(dǎo)預(yù)測的氨基酸序列在NCBI上作BLAST比較，結(jié)果顯示，其RRM結(jié)構(gòu)域氨基酸與小麥TaGRP2、大麥GRP HORVU、水稻OsGRP1、玉米grp1、擬南芥AtGRP7的RRM結(jié)構(gòu)域氨基酸序列一致性分別為99%、99%、79%、81%、81%，說明該結(jié)構(gòu)域具有較強的保守性（圖5）。運用MEGA31軟件構(gòu)建了TaLTR基因編碼的蛋白與其他物種同源蛋白的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明，來源于單子葉植物的蛋白序列與雙子葉植物的同源蛋白明顯分為兩支，而在單子葉植物這一支上TaLTR與小麥TaGRP2、大麥GRP HORVU聚在一起（圖6）。

迄今為止，尚未見對小麥TaGRP2和大麥GRP HORVU基因功能研究的報道。對擬南芥同源基因AtGRP7基因功能的研究發(fā)現(xiàn)，AtGRP7是冷脅迫過程中的一個RNA伴侶因子，其N-端的RRM結(jié)構(gòu)域在冷脅迫適應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用[5]。研究還發(fā)現(xiàn)，AtGRP7基因通過抑制開花抑制子FLC的表達(dá)控制植物由營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)換[6]。不同物種的TaLTR同源蛋白的RRM結(jié)構(gòu)域具有極高的保守性，預(yù)示它們在功能上可能也具有某些相似性。小麥TaLTR基因是否具有擬南芥AtGRP7基因同樣的功能還有待進一步實驗驗證。

23基于半定量RT-PCR的TaLTR基因在干旱、鹽和低溫脅迫下的初步表達(dá)分析

無論在根中還是在葉中，干旱、高鹽和低溫脅迫都可誘導(dǎo)TaLTR基因的表達(dá)量增加。18% PEG6000和200 mmol/L NaCl誘導(dǎo)的TaLTR基因表達(dá)在受脅迫6～12 h達(dá)到峰值，之后會逐漸下降恢復(fù)到正常水平（圖7A、7B和7D、7E）；而該基因的表達(dá)在4℃低溫處理05 h到72 h持續(xù)升高，恢復(fù)到室溫后基因表達(dá)量也相應(yīng)恢復(fù)到原有水平（（圖7C和7F）。上述結(jié)果表明，TaLTR基因可以應(yīng)答干旱和高鹽的脅迫，但其表達(dá)增強時間很短，有可能是一種應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果；而在小麥適應(yīng)冷脅迫過程中，該基因無論根中還是葉中表達(dá)量持續(xù)升高，推測它在應(yīng)答低溫脅迫中起更重要作用。結(jié)合序列同源性分析的結(jié)果，初步推測，TaLTR基因在小麥冷脅迫適應(yīng)過程中，可能與小麥花期轉(zhuǎn)換、調(diào)控春化作用相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。

3結(jié)論

本研究克隆了小麥山融3號TaLTR基因，通過對其進行序列分析以及RT-PCR半定量初步表達(dá)分析，推測TaLTR基因可能在應(yīng)對低溫脅迫時起到重要作用。該基因同時還受到高鹽和干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。TaLTR基因具體行使哪些功能，是否可調(diào)控春化相關(guān)基因表達(dá)進而影響植物開花時間，需要進一步的實驗驗證。這些問題的解決或許將有助于揭示作物低溫應(yīng)答機制，為研究小麥抗逆生理機制以及抗逆育種提供基礎(chǔ)材料。

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