甲磺酸達氟沙星溶液微生物限度檢查方法驗證研究

摘 要：目的：甲磺酸達氟沙星溶液微生物限度檢查方法驗證。方法：根據該樣品的微生物限度標準，按《中國獸藥典》2010年版附錄微生物限度檢查法的驗證試驗指導原則，用甲磺酸達氟沙星溶液進行驗證試驗，以考察確定甲磺酸達氟沙星溶液微生物限度的檢查方法。

關鍵詞：微生物限度檢查方法； 驗證； 甲磺酸達氟沙星溶液

中圖分類號：R927.12 文獻標識碼：A 文章編號：1006-3315（2013）03-178-001

材料：

1.供試品：甲磺酸達氟沙星溶液，規格：100ml，批號：120601

2.培養基及稀釋劑：營養瓊脂培養基，玫瑰紅鈉瓊脂培養基，膽鹽乳糖培養基，MUG培養基，麥康凱培養基，改良馬丁培養基，營養肉湯培養基。PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

3.驗證用標準菌株：金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，白色念珠菌 [CMCC（F）98001]，黑曲霉菌[CMCC（F）98003]。上述標準菌株均源自中國醫藥細菌保藏中心，驗證試驗所用的菌株均為第二代。

實驗部分：

1.菌液制備：按照《中國獸藥典》2010年版附錄要求，采用10倍稀釋法稀釋，取金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，大腸埃希菌的新鮮培養物接種至營養肉湯中30-35℃，培養18-24小時，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml含菌數為50-100cfu的菌懸液備用；取白色念珠菌的新鮮培養物接種至改良馬丁培養基中23-28℃，培養24-48小時，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml含菌數為50-100cfu的菌懸液備用。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，培養5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數50～100cfu 的孢子懸液。

2.供試液制備：取供試品10ml，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖至供試品分散均勻，制成1：10的供試液。

3.細菌，霉菌和酵母菌計數方法驗證

3.1薄膜過濾法（1）試驗組：取1：10供試品溶液10ml，過濾，用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100ml，沖洗5次，在最后一次沖洗液中加入50-100cfu/ml的金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，大腸埃希菌的試驗菌，濾干，取出濾膜，菌面朝上貼于營養瓊脂培養基上，置30～35℃培養3天，每株試驗菌平行制備2個平皿，分別加入6個平皿中。白色念珠菌，黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養基上，置23～28℃培養5天，每株菌平行制備2個平皿，計數。（2）菌液組：分別取上述稀釋的菌液1ml注入平皿內，每個菌平行制備2個平皿，測定所加的試驗菌數。（3）供試品對照組：取1：10供試品溶液10ml，過濾，用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100ml，沖洗5次，以測定供試品的本底菌數。（4）稀釋劑對照組：用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品，加入50-100cfu/ml試驗菌，按試驗組的供試液制備方法和菌落數計數方法測定其菌數。

3.2結果說明：采用薄膜過濾法，試驗組金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉菌各試驗菌的回收率均高于70%，可采用薄膜過濾法（沖洗量500ml/膜）對本品進行細菌數，霉菌數和酵母菌數測定。

4.控制菌檢查方法驗證

4.1大腸埃希菌檢查法（1）試驗組：取1：10供試品溶液10ml，薄膜過濾，用沖洗液沖洗5次，每次100ml，最后一次沖洗液中加入大腸埃希菌菌懸液1ml（10-100cfu），薄膜過濾，取出濾膜，放入100ml膽鹽乳糖培養基中， 35℃培養24小時，取0.2ml上述培養物加入5mlMUG培養基中，24小時后，加靛基質試液5滴，液面呈現玫瑰環。（2）陰性對照：照上述方法操作，最后一次沖洗時沖洗液中加入2ml金黃色葡萄球菌菌液，薄膜過濾，取出濾膜加入50ml膽鹽乳糖培養基中，于35℃培養24小時，再取上述培養物劃線接種于麥康凱培養基的平板上，于35℃培養24小時，未發現有金黃色葡萄球菌典型菌落。（3）陽性對照組：取大腸埃希菌試驗菌液10-100cfu接種至膽鹽乳糖增菌培養基，依據大腸埃希菌檢查法試驗生長良好。

4.2試驗結果：可采用薄膜過濾法（取1：10供試品溶液10ml，薄膜過濾，用沖洗液沖洗5次，每次100ml）對本品進行控制菌（大腸埃希菌）檢查，試驗組，陽性對照組均檢出大腸埃希菌，陰性對照組無菌生長。

結論：

本品按照《中國獸藥典》2010年版附錄“微生物限度檢查法”要求進行方法學驗證試驗。結果金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉菌各試驗菌的回收率均高于70%，按照《中國獸藥典》2010年版附錄“微生物限度檢查法”進行控制菌的方法學驗證試驗及檢查，控制菌檢查陽性菌生長良好，說明本品對大腸埃希菌沒有抑菌作用，陰性菌均未檢出，說明該控制菌檢查方法的專屬性好，可用于控制菌檢查。

參考文獻：

[1]中華人民共和國獸藥典【M】2010年版，2010，附錄143

[2]獸藥質量標準，2003年版，2003，34