家蠶幼蟲體中1-脫氧野尻霉素含量的變化

陳亞潔，劉淑梅，崔振騰，曾 鵬，金衛(wèi)明，費(fèi)建明，李玉峰，時(shí)連根

（1.浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058； 2.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 湖州 313000）

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojimycin，DNJ）是一種天然哌啶生物堿，最早由Yoshiaki等于1976從桑根和桑枝中分離獲得[1]，此后從桑葉、野跖草、風(fēng)信子等植物和淺紫灰鏈霉菌等微生物中也相繼分離出DNJ[2～4]。由于DNJ具有高效竟?fàn)幮砸种痞?葡萄糖苷酶的藥理活性，可被用于治療糖尿病等疾病，所以受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[5～6]。家蠶（Bombyx mo?ri）為重要經(jīng)濟(jì)資源昆蟲，其幼蟲吃進(jìn)桑葉，合成出有用物質(zhì)，是一個(gè)高效的生物反應(yīng)器。不同品系、不同品種的家蠶幼蟲，具有不同的遺傳特性、生長特點(diǎn)與物質(zhì)代謝等，對桑葉的食下、消化、吸收等情況存在差異。這些因素是否會(huì)影響家蠶幼蟲體中DNJ含量，探明這一問題對于合理開發(fā)利用家蠶幼蟲體中DNJ具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 家蠶幼蟲粉

12個(gè)原種（菁松、皓月、浙蕾、春曉、春蕾、鎮(zhèn)珠、秋豐、白玉、豐1、54A、薪杭、白云）和12個(gè)雜交種（菁松×皓月、皓月×菁松、浙蕾×春曉、春曉×浙蕾、春蕾×鎮(zhèn)珠、鎮(zhèn)珠×春蕾、秋豐×白玉、白玉×秋豐、豐1×54A、54A×豐1、薪杭×白云、白云×薪杭）由浙江省蠶種公司提供，1個(gè)多化性品種（MP）為本系種質(zhì)資源與分子育種實(shí)驗(yàn)室保存。取不同品種家蠶，在不同季節(jié)用桑葉常規(guī)飼育至5齡第3 d，饑餓12 h后-70℃冷凍保存。使用冷凍干燥，低溫超微粉碎并過80目篩，為供試驗(yàn)用的家蠶幼蟲粉。

1.2 試劑及標(biāo)準(zhǔn)品及主要儀器

1-脫氧野尻霉素氫氯化合物（1-DEOXYNOJIR?IMYCIN Hydrochloride，DNJ-HCI）和9-芴基氯甲酸甲酯（9-Fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-CI）均為SIGMA-ALDRICH公司產(chǎn)品；乙腈（色譜純）和其它試劑（分析純）均購自中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司；水為雙重蒸水。

Waters 600高效液相色譜儀為Waters公司產(chǎn)品；CHRISTPHA2-4型冷凍干燥機(jī)為BMH INSTRU?MENTS（HK）CO.LTD產(chǎn)品；BFM-6BI低溫超微粉碎機(jī)為濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 試樣液的制備

精確稱取家蠶幼蟲體粉約0.02 g，以0.05 mol/L的HCI為溶劑，渦流15 s成懸浮液。超聲波處理30 min后，用21690 g離心20 min，沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試品液。

取10 μL 供試品液，與10 μL 0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液（pH8.5）混和。加入20 μL 5 mmol/L FMOC-CI（溶解在50%乙腈中），迅速混勻并在20℃水浴鍋中反應(yīng)20 min。加10 μL 0.1mol/L甘氨酸液，通過中和剩余的FMOC-CI來終止反應(yīng)。反應(yīng)液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀釋，以穩(wěn)定生成的DNJ-FMOC。用孔徑0.2 μm尼龍吸管式過濾器過濾，收集濾過液即得試樣液。

1.4 DNJ含量的測定

采用高效液相色譜法。色譜條件：色譜柱為DI?AMONSIC C18柱（250×4.60 mm，ID），流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸（1∶1，V/V），流速1.0 mL/min，柱溫為室溫（25℃），檢測器為Waters 474熒光檢測器（激發(fā)光254 nm，發(fā)射光322 nm），軟件資料為Millennium32工作站，進(jìn)樣量10 μL，用外標(biāo)法計(jì)算其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同性別家蠶幼蟲體中DNJ含量的差異

調(diào)查秋豐×白玉5齡第3d幼蟲體中DNJ的含量，雌蠶體為0.32%，雄蠶體為0.48%（表1）。結(jié)果顯示不同性別蠶體中DNJ的含量存在差異，雄蠶體的高于雌蠶體，此結(jié)果與黃酮類化合物的含量[7]相一致。

表1 不同性別家蠶幼蟲體中的DNJ含量Table 1 The quantity of DNJ in different sex silkworm larva

2.2 不同季節(jié)飼養(yǎng)家蠶幼蟲體中DNJ含量的差異

調(diào)查不同季節(jié)用相同技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)與桑葉飼養(yǎng)的秋豐×白玉5齡第3 d幼蟲體中DNJ的含量，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明：同一蠶品種在不同飼養(yǎng)季節(jié)間，其幼蟲體中DNJ的含量存在差異，春季飼養(yǎng)的＞秋季飼養(yǎng)的＞夏季飼養(yǎng)的。

表2 不同飼養(yǎng)季節(jié)家蠶幼蟲體中的DNJ含量Table 2 The quantity of DNJ in silkworm larva reared on different season

2.3 不同品種家蠶幼蟲體中DNJ含量的差異

分別取中系、日系、多化、春用、夏秋用的原種和雜交種共25個(gè)品種的5齡第3 d家蠶幼蟲粉，測定其DNJ含量，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明：①家蠶幼蟲體中DNJ的含量，在品種間存在明顯差異，高低相差2.04倍；②供試品種除菁松（原種）和鎮(zhèn)珠×春蕾（雜交種）外，雜交種蠶體中DNJ含量高于原種蠶體中DNJ含量；③多化性品種蠶體中DNJ含量除低于二化性品種白玉外，均高于中系和日系的二化性品種蠶體中含量，但中系與日系的二化性品種蠶體間，其DNJ含量互有高低。

表3 不同品種家蠶幼蟲體中DNJ含量的差異Table 3 The quantity of DNJ in different variety silkworm larva

3 討論

DNJ通過高效竟?fàn)幮砸种茩C(jī)體小腸的α-糖苷酶活性，來降低機(jī)體腸道對碳水化合物的消化和葡萄糖的吸收，從而起到高效降低血糖的作用[5，6]。用家蠶幼蟲制成的全蠶粉具有顯著的降血糖作用，已分別由國內(nèi)外學(xué)者Ryu 等8]、桂仲爭等[9，10]、陳智毅等[11]、肖輝等[12]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中得到了證實(shí)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，家蠶幼蟲體富含DNJ，并且其DNJ含量在不同品種、不同性別、不同飼養(yǎng)季節(jié)間存在明顯差異。在供試的25個(gè)蠶品種中，DNJ含量最高的54A×豐1為0.53%，最低的54A為0.26%，二者相差2.04倍。雄蠶體中的DNJ含量高于雌蠶體中的含量；同一蠶品種在不同飼養(yǎng)季節(jié)間，其蠶體中DNJ含量，春季飼養(yǎng)的＞秋季飼養(yǎng)的＞夏季飼養(yǎng)的。本研究結(jié)果對于推進(jìn)家蠶幼蟲資源的藥用開發(fā)以及制備高DNJ含量的家蠶幼蟲體產(chǎn)品等，均具有積極的指導(dǎo)意義。

家蠶以桑葉為飼料，一般桑葉中DNJ含量約為0.11%，而家蠶幼蟲體中DNJ含量均大大高于桑葉中DNJ含量，其中54A×豐1（0.53%）品種幼蟲體中DNJ含量高出桑葉近5倍。此結(jié)果從一個(gè)側(cè)面反映出了家蠶幼蟲體具有累積或合成DNJ的機(jī)能，是累積作用還是合成作用，或者是二者均存在，還有待于通過分析比較桑葉中生物堿與蠶體中生物堿的種類、結(jié)構(gòu)等來加于確定，此方面的研究工作正在進(jìn)行中。

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