153Sm-Annexin V凋亡顯像的實驗研究

劉 江 趙穎如 王 健 孫雷娜 牛瑞芳 徐文貴

放化療是惡性腫瘤除手術外的常規治療手段，其治療腫瘤的機制之一是干擾DNA的合成及細胞的分裂，從而誘導腫瘤細胞產生凋亡，達到抑制或清除腫瘤的目的。細胞凋亡早期，細胞膜脂雙層內層的磷脂酰絲氨酸（phosphatidyl serine，PS）外翻，暴露于細胞膜表面，可與Ca2+依賴性磷脂結合蛋白Annexin V快速緊密的特異性結合。體外應用放射性核素標記Annexin V后引入體內，Annexin V迅速與細胞凋亡級聯反應初始事件的外翻PS結合，通過SPECT探測放射性核素衰變時釋放的γ光子，間接使凋亡細胞示蹤達成凋亡顯像。細胞凋亡是一個連續動態時間較長的生物學過程，由于99mTc的半衰期相對較短，不利于連續追蹤監測及捕捉細胞凋亡活動的高峰期，進而確立最佳凋亡顯像時間窗等，故本研究嘗試選用半衰期相對較長的153Sm標記Annexin V進行凋亡顯像，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑153Sm購自北京原子高科有限技術公司；人基因重組Annexin V購自Sigma公司，美國；二乙三胺五醋酸（DTPA），吡啶，乙酸酐，無水乙醇，甲基亞礬等化學試劑（均為國產分析純）。

1.1.2 儀器 SPECT購自美國GE公司；活度計購自美國CAPINTEC，INC公司；γ計數器購自美國Centocor公司。

1.1.3 實驗動物 長耳白家兔（2.2～2.5 kg，雄性）及昆明品系小鼠（20～30 g，雌雄各半），均購自天津市動物中心。

1.1.4 細胞及動物模型 人肺小細胞癌細胞株NCIH446、接種鼠源肺癌細胞的荷瘤小鼠的對照組及誘導凋亡組均由本院中心實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 環DTPA法標記153Sm-Annexin V 環DTPA制備：取DTPA 1g，乙酸酐2 mL，吡啶12mL放入棕色瓶內進行反應。反應溫度為66～67℃，時間為24 h，抽濾經乙酸酐、無水乙醇各洗3次后自然風干所得白色粉末即為環DTPA。取Annexin V（200 μg/mL）0.5 mL，環DTPA的甲基亞礬溶液，緩沖液為NaHCO3（濃度0.1 mol/L，pH 8.2），于24～26℃反應1 h，用PBS（濃度0.1 mol/L，pH 為7.4，含NaCl 0.1 mol/L）透析除雜質，并在無菌情況下進行除菌過濾，分裝在無菌瓶中，密封后置于4℃的冰箱內保存備用。顯像前加入10mCi放射性核素153Sm搖勻，靜置5～30 min可得無色透明液體153Sm-DTPA-Annexin V，即153Sm-Annexin V。

1.2.2 物理、化學、生物學檢測153Sm-Annexin V：無色透明，pH為7.4，比活度為100 μg/10 mCi/2 mL。放化純RCP：薄層層析法測定RCP＞90%，37℃靜置3 h后測得RCP約≥90%。標記率采用蛋白透析方法，將標記好的153Sm-Annexin V放入透析袋內，透析外液為PBS 800 mL，放入4℃冰箱內透析過夜，利用γ計數器分別測量透析袋內、外液的CPM值，為CPM內和CPM外。按公式計算其標記率R：R=CPM內/（CPM內+CPM外）×100%。透析法測得153Sm-Annexin V標記率為88.6%。檢菌：將1支153Sm-Annexin V注入盛有培養液的培養瓶中，于37℃保溫1周，未見有細菌檢出。熱原檢測：雄性長耳白家兔3只，體質量2～2.5 kg，將1支153Sm-AnnexinV靜脈注入，注藥后監測家兔體溫無明顯升高。毒理測定：昆明品系小鼠30只，雌雄各半，體質量20～30 g，分為3組，每組10只。每組鼠尾靜脈內分別注入153Sm-Annexin V相當于人用量的100、500和1 000倍，1周內觀察小鼠死亡情況，計算得出LD50＞333 μg/kg體質量。應用家兔進行血漿藥代動力學測定：雄性長耳白家兔3只，每只耳緣靜脈注入3 μg/300 μCi153Sm-Annexin V，分別于注藥后10、20、30 min，以及1、2、3、5、6、12、24、48、72 h取血0.2 mL備用。利用γ計數器測其1min的放射性計數CPM值，以每毫升血中CPM值代表血藥濃度，繪制放射性核素標記Annexin V的時量曲線。計算得出血漿半衰期13 min。

1.2.3 體外細胞培養凋亡顯像實驗 人肺小細胞癌細胞株NCIH446及環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）誘導凋亡細胞模型均由本院中心實驗室提供，顯像前37℃加入153Sm-Annexin V（0.1 μg/10 μCi）并恒溫保持1h，SPECT平面靜態采集圖像分析。SPECT靜態采集方法：配備低能高分辨平行孔準直器，矩陣1 024×256，能峰103KeV，窗寬20%。應用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記Annexin V聯合碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色法測定細胞凋亡作陽性對照。

1.2.4 荷瘤小鼠動物凋亡顯像實驗 接種鼠源肺癌細胞的荷瘤小鼠及經CTX誘導凋亡動物模型均由本院中心實驗室提供，經鼠尾靜脈注射153Sm-Annexin V（3 μg/300 μCi）后0.5～4 h應用SPECT平面靜態采集圖像，采集方法同上。應用TUNEL染色測定細胞凋亡作陽性對照。

2 結果

2.1 體外細胞培養凋亡顯像實驗

對照組：即人肺小細胞癌細胞株NCIH446未經CTX誘導凋亡，加入153Sm-Annexin V不能產生特異性結合，中央區培養細胞部位無放射性濃集，呈陰性（圖1A）。實驗組：即人肺小細胞癌細胞株NCIH446經CTX誘導凋亡，加入153Sm-Annexin V產生特異性結合，中央區培養細胞部位出現放射性濃集，呈陽性（圖1B），經Annexin V-FITC/PI聯合染色法證實（圖1C）。

圖1 體外細胞培養凋亡顯像實驗及Annexin V-FITC/PI聯合染色Figure1 Apoptosis imaging in cultured cells and Annexin V-FITC/PI joint staining results

2.2 荷瘤小鼠動物凋亡顯像實驗

對照組：即接種肺癌細胞的荷瘤小鼠未經CTX誘導凋亡，加入153Sm-Annexin V不能產生特異性結合，腫瘤組織部位無放射性濃集（箭頭處），呈陰性（圖2A），本底為自發凋亡或壞死影像。實驗組：即接種肺癌細胞的荷瘤小鼠經CTX誘導凋亡，加入153Sm-Annexin V產生特異性結合，腫瘤組織部位可見放射性濃集（箭頭處），呈陽性（圖2B），腫瘤組織經TUNEL染色檢測證實（圖2C）。

圖2 荷瘤小鼠動物凋亡顯像實驗及TUNEL染色Figure2 Apoptosis imaging in tumor-bearing mice and animals and results of TUNEL staining

3 討論

1972年Kerr等［1］首次提出生物學“細胞凋亡”概念。現今已涉及器官移植、心臟疾病、中樞神經系統疾病、惡性腫瘤治療及急性血栓診斷等多個領域。應用放射性核素標記Annexin V進行體內凋亡顯像是近年來研究熱點之一。細胞凋亡（cell apoptosis），又稱為程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD），是一種區別于細胞壞死的由多種基因調控的主動性細胞死亡過程，可見于胚胎發育、組織發生、組織分化、免疫調節等諸多生理現象和惡性腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病、艾滋病等多種病理情況［2-3］。腫瘤的發生不僅與細胞異常增殖、分化有關，而且還與細胞凋亡的異常密切相關。細胞凋亡的減少或受到抑制會破壞細胞增殖和死亡之間的平衡，使得細胞增殖相對活躍并最終導致腫瘤的發生［4］。抗腫瘤治療的機制之一是干擾DNA的合成及細胞的分化，誘導腫瘤細胞產生凋亡。因此，進行細胞凋亡的檢測可以評估腫瘤對治療的敏感性和耐受程度，預測療效并對進一步治療方案的選擇制定給予指導，而且還可以為抗腫瘤的新藥研發提供有力佐證［5-7］。細胞凋亡的檢測分為體內和體外兩種，體外法為取材后離體檢測，取材會對人體組織器官造成創傷不能反復連續使用，離體檢測也只能反映某一時間點細胞凋亡，不能實時動態監測活體內凋亡的發生、發展過程。體內檢測主要依靠影像學完成，具有活體、無創、實時監測等優勢而被臨床廣泛研究和應用。

放射性核素凋亡顯像是研究最早成熟的體內凋亡探測技術，其原理在于利用核素標記化合物與細胞凋亡過程中產生的特異性靶結合，使放射性核素濃聚在細胞凋亡部位而達到顯示細胞凋亡的目的。磷脂酰絲氨酸PS是構成細胞膜的帶負電荷的磷脂成分，依靠翻轉酶（floppase）、移位酶（translocase）兩種ATP能量依賴酶的作用來維持其內向性，正常狀態下位于細胞膜脂雙層的內層。細胞凋亡早期，細胞內Ca2+濃度增加，導致翻轉酶、移位酶失活的同時激活爬行酶（scramblase）使PS外翻，即PS由內膜移向外膜暴露于細胞表面［8-10］。目前認為，PS外翻是細胞凋亡級聯反應的初始事件［11］。膜聯蛋白V（Annexin V）是一種人體內源性蛋白，不具抗原性，屬于Ca2+依賴性磷脂結合蛋白家族，在Ca2+存在的情況下，Annexin V能與PS快速緊密的特異性結合［12-13］。體外應用放射性核素標記Annexin V后引入體內，仍保持原有生物活性的Annexin V能迅速與細胞凋亡級聯反應初始事件的外翻PS結合，通過單光子發射型計算機斷層顯像儀（single photon emission computed tomography，SPECT）探測放射性核素衰變時釋放的γ光子，間接使凋亡細胞示蹤，實現凋亡顯像。

Belhocine等［14］應用99mTc-Annexin V對15例惡性腫瘤患者（肺癌10例、淋巴瘤3例、乳腺癌2例）在第1次化療后進行凋亡顯像，其中8例腫瘤部位攝取陽性，追蹤隨訪治療有效；5例腫瘤部位攝取陰性，追蹤隨訪治療無效；另外2例乳腺癌患者腫瘤部位攝取陰性，但追蹤隨訪治療有效，結果顯示99mTc-Annexin V可用于肺癌及淋巴瘤的療效評價，在乳腺癌中的應用需進一步研究。Kartachova等［15］對38例受試者（淋巴瘤3l例，非小細胞肺癌4例，頭頸部鱗狀細胞癌3例）在治療前后分別進行99mTc-Annexin V凋亡顯像，分析得出顯像結果與治療效果之間呈正相關。以上研究均表明放射性核素標記的Annexin V凋亡顯像可用于人體內臨床評價腫瘤的早期治療效果。本研究發現153Sm-Annexin V體外標記率及放化純高，化學性質穩定，無菌、無熱原，毒理測定合格適于人體內凋亡顯像。進一步研究證實體外細胞培養及荷瘤小鼠動物凋亡顯像均陽性，為應用放射性核素153Sm-Annexin V在抗腫瘤治療前后進行人體內的凋亡顯像奠定基礎。同時153Sm半衰期較長（46 h），可以克服99mTc半衰期較短（6 h）凋亡顯像時重復注射的弊端，更容易進行連續追蹤監測、捕捉細胞凋亡活動的高峰期，進而確立最佳凋亡顯像時間窗，有更為廣闊的臨床應用前景。

值得注意的是，細胞壞死時出現細胞膜整合性喪失，同樣可以使PS外翻，進而在凋亡顯像中呈陽性，故放射性核素體內凋亡顯像尚無法區分細胞壞死和細胞凋亡，153Sm-Annexin V凋亡顯像亦是如此。同時本研究采用的153Sm-Annexin V進行凋亡顯像時有肝脾攝取偽影，不適用于上腹部的腫瘤的監測評估。另外，本實驗組也將對153Sm-Annexin V在荷瘤小鼠體內的生物學分布；同一種荷瘤小鼠對不同化療藥物組合誘導凋亡的最佳顯像時間窗以及不同荷瘤小鼠對其相應化療藥物誘導凋亡的最佳顯像時間窗進行進一步的實驗研究。

1 Kerr JFR,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:A Basic Biological Phenomenon With Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics[J].Br J Cancer,1972,26:239-257.

2 Glaser M,Goggi J,Smith G,et al.Improved radiosynthesis of the apoptosis marker 18F-ICMT11 including biological evaluation[J].Bioorg Med Chem Lett,2011,21(23):6945-6949.

3 Fortt R,Smith G,Awais RO,et al.Automated GMP synthesis of[(18)F]ICMT-11 for in vivo imaging of caspase-3 activity[J].Nucl Med Biol,2012,39(7):1000-1005.

4 Shi H,Kwok RT,Liu J,et al.Real-time monitoring of cell apoptosis and drug screening using fluorescent light-up probe with aggregation-induced emission characteristics[J].J Am Chem Soc,2012,134(43):17972-17981.

5 Lederle W,Arns S,Rix A,et al.Failure of annexin-based apoptosis imaging in the assessment of antiangiogenic therapy effects[J].EJNMMI Res,2011,1(1):26.

6 Sobrio F,Medoc M,Martial L,et al.Automated Radiosynthesis of[(18)F]ML-10,a PET Radiotracer Dedicated to Apoptosis Imaging,on a TRACERLab FX-FN Module[J].Mol Imaging Biol,2013,15(1):12-18.

7 Sun IC,Lee S,Koo H,et al.Caspase sensitive gold nanoparticle for apoptosis imaging in live cells[J].Bioconjug Chem,2010,21(11):1939-1942.

8 Vangestel C,Peeters M,Oltenfreiter R,et al.In vitro and in vivo evaluation of[99mTc]-labeled tricarbonyl His-annexin A5 as an imaging agent for the detection of phosphatidylserine-expressing cells[J].Nucl Med Biol,2010,37(8):965-975.

9 Vangestel C,Peeters M,Mees G,et al.In vivo imaging of apoptosis in oncology:an update[J].Mol Imaging,2011,10(5):340-358.

10 Wang MW,Wang F,Zheng YJ,et al.An in vivo molecular imaging probe(18)F-Annexin B1 for apoptosis detection by PET/CT:preparation and preliminary evaluation[J].Apoptosis,2013,18(2):238-247.

11 Niu G,Chen X.Apoptosis imaging:beyond annexin V[J].J Nucl Med,2010,51(11):1659-1662.

12 Yang TJ,Haimovitz-Friedman A,Verheij M.Anticancer therapy and apoptosis imaging[J].Exp Oncol,2012,34(3):269-276.

13 De Saint-Hubert M,Wang H,Devos E,et al.Preclinical imaging of therapy response using metabolic and apoptosis molecular imaging[J].Mol Imaging Biol,2011,13(5):995-1002.

14 Belhocine T,Steinmetz N,Hustinx R,et al.Increased uptake of the apoptosis-imaging agent(99m)Tc recombinant human Annexin V in human tumors after one course of chemotherapy as a predictor of tumor response and patient prognosis[J].Clin Cancer Res,2002,8(9):2766-2774.

15 Kartachova MS,Valdés Olmos RA,Haas RL,et al.99mTc-HYNIC-rh-annexin-V scintigraphy:visual and quantitative evaluation of early treatment-induced apoptosis to predict treatment outcome[J].Nucl Med Commun,2008,29(1):39-44.