白細胞介素-18基因啟動子多態性與鼻咽癌遺傳易感性的研究

潘國剛， 羅 斌，滕元姬，梁麗娜

(右江民族醫學院附屬醫院檢驗科，廣西百色533000)

鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種多基因、多因素綜合作用而導致的一種常見疾病，然其病因和發病機制尚未完全闡明，但遺傳基因在鼻咽癌發病過程中可能起著重要的作用，隨著人類基因組計劃的迅速發展，NPC相關基因的定位和識別已成為研究的熱點。白細胞介素-18(interleukin-18，IL-18)是一種多效性細胞因子，主要由激活的單核巨噬細胞產生，可誘導γ-干擾素 (interferon-γ，IFN-γ)產生，參與了多種疾病病理過程，在感染、免疫調節、腫瘤發生中的作用受到廣泛關注［1-2］。近年對IL-18基因多態性與疾病的關系有較多研究報道。但是，IL-18在腫瘤發生和進程中的分子機制還尚未完全闡明。IL-18基因位于11號染色體長臂上(11q22.2-q22.3)，由6個外顯子和5個內含子組成，分子生物學研究表明IL-18基因存在著單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)。這種基因多態性與人類多種腫瘤、霍奇金病及自身免疫性疾病的關系［3-5］已成為國內、外學者研究的熱點。目前，有關IL-18基因多態性與NPC關系的研究國內較少文獻報道。為此，我們采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)的方法，研究IL-18基因多態性及單倍型與NPC的關系，為認識NPC的發病機制提供一定的理論依據。

材料和方法

一、研究對象

全部NPC來自于右江民族醫學院附屬醫院住院的患者，全部研究對象均經病理證實，共190例，其中男135例，女55例，年齡(48±8)歲;選擇年齡、性別相匹配的200名無血緣關系的同期正常健康體檢者為對照組，其中男140名，女60名，年齡(47±8)歲。全部研究對象均為廣西籍人。該研究獲得右江民族醫學院附屬醫院倫理委員會批準，且以上標本采集均由本人知情同意。

二、研究方法

1.基因組DNA提取 采集靜脈血3mL，用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝;采用改良碘化鈉法提取白細胞基因組DNA，-70℃保存備用。

2.PCR擴增 參照Genbank公布的序列(NT033899.7)設計2對引物，由上海英俊有限公司合成。(引物序列的起止位置為:-655位點至-519位點)用于特異性擴增IL-18基因包含-607位點的一段 DNA引物序列，上游引物為:5'-CCCTCTCCCCAAGCTTACTT-3';下游引物為:5'-TTCAGTGGAACAGGAGTCCA-3';(引物序列的起止位置為:-366位點至-111位點)用于特異性擴增IL-18基因包含-137位點的一段DNA引物序列，上游引物為:5'-TTGTAACATTGTAGGAATTACC-3';下游引物為:5'-ATGTAATATCACTATTTTCATGAGA-3'，IL-18的PCR擴增反應體系均為25 μL，其中含 10 ×PCR 緩沖液 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各 20 pmoL，模板 DNA 2.0 μL，TaqDNA 聚合酶1.25 U，不足體積用滅菌雙蒸水補足至25 μL。置熱循環儀(Bio-Rad)中94℃預變性5 min;再按下列程序循環35次，即94℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸55 s;末次循環后，72℃延伸5 min。

3.擴增產物的限制性酶切 取PCR擴增產物3 μL，分別用2 U限制性內切酶Mse I和BfuC I(英國Biolabs公司)酶切IL-18基因-607和-137位點，37℃孵育3h，反應終止后，消化片段在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，EB染色，染色后通過凝膠成像系統判斷結果。

三、統計學方法

用SPSS11.5軟件包進行分析?；蛐秃偷任换蝾l率采用基因直接計數法計算，研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度及各組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，并以比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區間(confidence interval，CI)表示相對風險度。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、IL-18基因型檢測結果

IL-18基因-137 G/C多態性，PCR擴增產物片段大小為256 bp，根據限制性內切酶BfuC I酶切片段的情況，檢測到基因型有3種，CC型(256 bp 1條帶)，GC 型(256 bp，229 bp和27 bp 3條帶)，GG型(229 bp和27 bp 2條帶)，見圖 1;IL-18基因-607 C/A多態性，PCR擴增產物片段大小為137 bp，根據限制性內切酶Mse I酶切片段的情況，檢測到基因型有3種，AA型(91 bp，46 bp 2條帶)，CA 型(137 bp，91 bp和46 bp 3條帶)，CC型(137 bp 1條帶)，見圖2。為驗證基因型結果，PCR產物直接測序結果與Genbank參照序列(NT033899.7)相一致，見圖3～4。

二、NPC與對照組IL-18基因多態性的比較

IL-18基因型在2組人群中分布頻率，經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，2組均達到遺傳平衡，具有群體代表性。經χ2檢驗及相關分析，IL-18-137位點等位基因頻率在2組人群中的分布差異有統計學意義(χ2=9.895，P＜0.05);等位基因頻率的相對風險分析發現，C等位基因攜帶者患NPC的風險是G等位基因的1.730倍(OR=1.730，95%CI:1.227～2.439);IL-18 基因-607 C/A多態性在2組人群中的分布差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

三、NPC組與對照組IL-18基因的連鎖不平衡及單倍型分析

應用單倍型SHEsis分析軟件對IL-18基因-137 G/C和-607 C/A這2個位點的單核苷酸多態性進行連鎖不平衡分析，結果顯示IL-18基因-137 G/C與-607 C/A單核苷酸多態性存在強烈的連鎖不平衡(|D'|=0.951)。聯合基因型分析發現，3種單倍型分布頻率在NPC組與對照組間分布差異有統計學意義(χ2=9.530，P=0.009)，-137C/-607A單倍型攜帶者顯著增加了NPC的發病風險(OR=1.699，95%CI:1.174～2.457)，見表2。

四、NPC多因素Logistic回歸分析

將全體研究對象作為整體進行分析，以性別、年齡、吸煙、飲酒、IL-18基因-137 G/C和-607 C/A多態性作為自變量，建立NPC的Logistic回歸模型，見表3。經混雜因素調整后可見，IL-18基因-137 G/C多態性是NPC的獨立危險因素。其他相關的危險因素有吸煙、飲酒，與公認的NPC危險因素相符。

圖1 IL-18基因-137 G/C多態性8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖2 IL-18基因-607 C/A多態性8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖3 IL-18基因-137 G/C測序圖

圖4 IL-18基因-607C/A測序圖

表1 NPC組與對照組IL-18基因多態性分布頻率的比較

表2 NPC組與對照組IL-18基因單倍型分布頻率的比較

3 討 論

NPC是由環境因素和遺傳基因相互作用而導致的一種頭頸部惡性腫瘤。然其病因和發病機制尚未完全闡明，但細胞因子在其中的作用越來越受到重視。IL-18是一種具有多種生物學功能的細胞因子，IL-18除能強烈地誘導免疫細胞釋放γ-干擾素(IFN-γ)、α-干擾素(TNF-α)等細胞因子外，其亦具有增強FasL表達和自然殺傷細胞(NK)細胞毒作用等多種生物學效能。IL-18在免疫調節、抗腫瘤及抗感染等方面有著潛在的應用前景，并與多種腫瘤的發病可能密切相關。近年來，許多臨床研究表明IL-18基因轉染到樹突狀細胞和乳腺癌細胞中均具有特異性和非特異性的抗腫瘤作用，認為IL-18在腫瘤的發病和活動性中可能起著重要的作用［6-7］。IL-18基因位于11號染色體長臂上，由6個外顯子和5個內含子組成。研究表明，IL-18基因具有遺傳多態性，這種基因多態性影響IL-18的基因轉錄和表達，進而影響到IL-18的生物學功能，從而影響到腫瘤的發生、發展。因而，我們推測IL-18基因多態性可能與腫瘤的易患性有關。

關于IL-18基因多態性與腫瘤的關系，文獻報道較少。Farjadfar等［8］檢測肺癌IL-18基因多態性，結果發現IL-18基因-607 C/A多態性與肺癌的發病具有相關性，其中-607 A等位基因頻率在肺癌患者中顯著高于對照組，-607 A等位基因攜帶者明顯降低血清IL-18的表達，因而提出-607 A等位基因攜帶者機體抗腫瘤減弱，從而導致肺癌易感。Nong等［9］通過對NPC IL-18基因多態性的研究發現，IL-18基因-137 G/C多態性與NPC的發病具有相關性，其中-137 C等位基因可能是NPC的遺傳易感基因;聯合基因型進一步發現，-137 C/-607 A單倍型攜帶者明顯增加了NPC的發病風險。但西班牙學者 Sáenz-López等［10］研究發現IL-18基因-137 G/C和-607 C/A兩位點多態性與腎細胞癌都具有相關性。由于基因多態性存在地域間的差異，IL-18基因多態性與NPC之間是否真正存在相關性，目前尚無定論。為進一步明確IL-18基因多態性是否與NPC的發生相關，我們采用病例-對照的研究方法對IL-18基因多態性進行分析，結果發現NPC患者IL-18基因-137 G/C多態性分布與正常人比較差異具有統計學意義，其中C等位基因攜帶者頻率在NPC組明顯高于對照組(P＜0.05)。本研究為排除年齡、生活習慣等混雜因素對統計結果的干擾，采用Logistic回歸分析后發現，IL-18基因-137 G/C多態性與NPC明顯相關，是NPC的一個獨立危險因素。聯合基因型進一步分析發現，IL-18基因-137 G/C與-607 C/A單核苷酸多態性存在強烈的連鎖不平衡(|D'|=0.951)，3種單倍型分布頻率在NPC組與對照組間分布差異有統計學意義(χ2=9.530，P=0.009)，-137 C/-607 A 單倍型攜帶者明顯增加了 NPC的發病風險(OR=1.699，95%CI:1.174～2.457)。結果提示，IL-18基因-137 G/C多態性和-137 C/-607 A單倍型與NPC的發病可能具有相關性，其中-137 C等位基因可能是NPC的遺傳易感基因。本研究結果與Nong等［3］報道相一致。

綜上所述，NPC是一種多因素參與的常見病，除環境因素影響之外，遺傳因素在其中也起著更為重要的作用，通過本研究可以發現，IL-18基因-137 G/C多態性和-137 C/-607 A單倍型與NPC的發病可能具有相關性，其中-137 C等位基因可能是NPC的遺傳易感基因。但IL-18基因多態性是通過何種機制對NPC產生影響以及在NPC發病中的確切分子機制尚待進一步研究。

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