抗血小板藥物治療監測的進展

喬 蕊，張 捷

(北京大學第三醫院檢驗科，北京100191)

抗血小板藥物在動脈粥樣硬化導致的血栓事件一級預防和二級預防中發揮著重要的作用。但是與降壓藥、降糖藥和降脂藥不同，臨床目前一般不根據抗血小板治療的效果而調整抗血小板藥物劑量。近年來，這種給予固定劑量的抗血小板藥物而不常規監測血小板抑制程度的做法受到挑戰。實驗室研究結果證明阿司匹林和二磷酸腺苷(ADP)受體拮抗劑(如氯吡格雷)存在廣泛的個體間差異［1-2］。前瞻性觀察研究提示阿司匹林和氯吡格雷的低反應性與不良心血管預后有關。初步的數據提示根據血小板試驗調整氯吡格雷劑量可以改善臨床預后［3-4］。因此重視發展安全有效的抗血小板治療的監測手段可能將非常有意義。

一、抗血小板藥物的機制

見表1和圖1。

表1 抗血小板藥物和機制

圖1 抗血小板藥物的機制

二、血小板功能試驗

血小板功能試驗可以測定每個患者血小板激活達到的程度。我們主要探討在心血管疾病背景下，目前用于監測抗血小板治療和預測血栓形成及出血的血小板功能試驗。

(一)血小板功能試驗

1.血小板聚集儀 血小板聚集儀的重復性受到很多因素的影響，包括采集試管內檸檬酸鈉濃度、血小板計數的調整情況、樣本保存時間、攪拌珠速率、溫度及血樣本的pH值等。比濁法血小板聚集測定是目前實驗室測定血小板功能廣泛使用的方法。該方法需要制備富含血小板的血漿(乏血小板血漿作為對照)，需要使用ADP、腎上腺素、膠原、花生四烯酸和瑞斯托霉素等引發聚集反應。該試驗通過測定加入誘導劑后，以整聯蛋白αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)依賴的血小板聚集引起的透射光變化來反應血小板的功能。優點:雖然方法設計之初是用于血小板功能缺陷檢測而不是用于預測血栓形成，但是仍是傳統的測定血小板功能的“金標準”方法。缺點:制備富含血小板血漿需要離心，可能導致血小板提前激活。電阻法血小板聚集測定被推薦作為比濁法的備選方法。該方法使用全血樣本測定，同樣以整聯蛋白αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)依賴的血小板聚集形成為檢測基礎。優點:不需要制備富含血小板的血漿，使用全血檢測，更具有生理學優點。缺點:檢測耗時長，費用高，通量低，不適合大量樣本檢測。

2.流式細胞術 流式細胞術雖然一般不進行常規檢測，但其可增強檢測止血潛能和血小板抑制治療反應的診斷能力。流式細胞術使用全血樣本進行檢測，而且必須迅速檢測以保持全血的“生理”環境。血小板表面的P選擇素、活化的整聯蛋白αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)和白細胞-血小板聚集體可通過流式細胞術測定［6］。整聯蛋白αⅡbβ3一般以靜息構象在血小板表面表達。隨著血小板激活，其構象會發生改變，只有特異性的單克隆抗體血小板相關補體-1(PAC-1)可以與這種激活構象結合。因此，PAC-1陰性的血小板是靜息狀態的血小板，PAC-1陽性的血小板是活化的血小板。血小板被激活后發生脫顆粒，同時P選擇素(一般表達于α顆粒膜表面)外化表達在血小板的表面［7-8］。因此，P選擇素陰性的血小板是靜息狀態的血小板，P選擇素陽性的血小板是活化的血小板。而且P選擇素陽性的血小板可以迅速的與白細胞表面的P選擇素糖蛋白(glycoprotein，GP)配體結合形成白細胞-血小板聚集體。循環中的白細胞-血小板聚集體(特別是單核細胞-血小板聚集體)是比循環中P選擇素陽性的血小板更敏感的體內血小板活化的標志物。優點:采用全血測定，需要的樣本量很少。可在標本固定后運往中心實驗室檢測，適用于多中心的臨床試驗［7］。缺點:檢測前樣本前處理復雜，設備(流式細胞儀)昂貴，對檢測技術人員的經驗要求高。因此，這種方法目前主要用于科研研究。活化舒血管磷蛋白(VASP)的磷酸化可通過商品化的試劑盒(BIOCytes，Marseilles，France)檢測［6］。這是一個對P2Y12拮抗劑作用特異的血小板功能檢測方法。如圖2所示，前列腺素E1與其血小板表面的磷酸肌醇受體結合，信號通過激活性G蛋白和AC將ATP轉化成環磷酸單腺苷，然后通過蛋白激酶A將VASP轉化成磷酸化的 VASP(VASP-P)［9］。VASPP調節GPⅡb/Ⅲa受體的活化。ADP與血小板表面的P2Y12受體結合，信號通過抑制性G蛋白抑制前列腺素E1誘導的AC信號的傳遞。P2Y12拮抗劑(例如氯吡格雷的活化代謝產物)能抑制這種ADP誘導的效應。因此，當前列腺素E1和ADP同時存在時，VASP-P與P2Y12拮抗的程度成比例。VASPP可使用透膜技術和對VASP-P特異的單克隆抗體進行測定。優點:VASP試驗以 P2Y12為特異靶目標，采用全血測定，所需樣本量少。而且，檸檬酸抗凝的全血樣本可以在室溫條件下，運送至中心實驗室檢測，非常適用與多中心的臨床試驗研究。缺點:樣本制備復雜，設備(流式細胞儀)昂貴，測定技術人員經驗要求高。

3.血栓彈力圖(TEG)TEG發明已有50多年，但是近年來才更新改造成TEG血小板圖記系統 (TEG platelet mapping system，Haemoscope，Niles，IL)［10］。該試驗測定血栓形成和溶解的動力學特性，定量測定ADP或花生四烯酸激活的血小板聚集對血凝塊形成的作用。優點:除采用全血測定外，主要優點是在測定血小板功能的同時，可以特異的測定血小板對凝血塊形成的貢獻。缺點:需要樣本前處理，檢測時間長，結果解釋需要專業人士，有關研究有限。

4.血栓烷測定 血栓烷A2在血小板激活的過程中釋放，并且很快代謝成穩定的血栓烷B2，血栓烷B2可在血清或血漿中被檢測到。優點:測定血栓烷B2旨在測定阿司匹林抑制COX-1的效應。缺點:測定血清/血漿中的血栓烷B2并不是直接的測定血小板的試驗，因此特異性差。尿11脫氫血栓烷B2是血栓烷A2在尿液中穩定的代謝形式，可被檢測到。優點:測定尿液中的11脫氫血栓烷B2旨在測定阿斯匹林抑制COX-1的效應。缺點:不是直接的測定血小板的試驗，特異性差。腎功能對該試驗有影響。

圖2 VASP-P試驗特異檢測P2Y12拮抗劑的抗血小板作用

(二)即時檢驗(POCT)和儀器

POCT由于具有很多潛在的優點，因此越來越得到臨床的重視。首先，POCT可以快速、可靠地評估止血潛能和治療反應;其次，僅需簡單的培訓、試劑處理、定標和一定的空間即可進行檢測;第三，這些新興的技術可能將成為凝血和血小板試驗有力的補充，可用于家中、流動門診、急診、血管成形術中心、冠心病監護病房和手術室的監測管理。目前臨床可供使用的檢測血小板功能的POCT試驗見表2。

1.VerifyNow VerifyNow(accumetrics，san diego，CA)以整聯蛋白 αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)依賴的血小板聚集為基礎［11］，是一種完全自動化的POCT。其試劑倉包含血小板激活劑和纖維蛋白原包被的珠子(血小板的聚集可以通過纖維蛋白原包被的的珠子被放大)。全血樣本直接裝載檢測，血小板的激活通過透光率來監測。

2.Plateletworks Plateletworks(helena laboratories，beaumont，TX)也以整聯蛋白 αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)依賴的血小板聚集為基礎。在枸櫞酸抗凝的血液中加入ADP或者膠原，誘導血小板聚集，然后測定血小板計數，通過與乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的對照管中的血小板計數比較，來反應血小板的活化能力［10］。

3.Impact cone and Platelet analyzer Impact cone and Platelet analyzer(DiaMed，Cressier，Switzerland)以剪切力誘導的血小板黏附聚集為終點。該試驗通過在高剪切力(1 800 s-1)條件下，監測血小板黏附聚集在一種塑料盤上的能力，來反應血小板的功能。剪切力對于血小板的功能非常重要［12］，特別是在冠狀動脈疾病(CAD)中。Impact analyzer可以調節剪切力，與CAD中的剪切力相關。

4.血小板功能分析儀-100(PFA-100)PFA-100是在高剪切壓力條件下模擬初期止血的試驗。依靠毛細管虹吸作用，檸檬酸鹽抗凝的全血通過膠原和腎上腺素或膠原和二磷酸腺苷包被的一個膜，膜上的孔隙在血小板黏附聚集后會被堵塞，試驗結果即為孔隙的被封閉時間。

三、監測抗血小板治療的方法

(一)監測阿司匹林治療

檢測血小板功能的試驗眾多，何種方法適用于阿司匹林抗血小板治療的監測呢?見表3。

表2 檢測血小板功能的POCT試驗

表3 可用于監測阿司匹林治療的試驗［14］

1.血清/血漿血栓烷B2和尿11脫氫血栓烷B2可被用于終點檢測。阿司匹林特異性的抑制血小板的COX-1，因而抑制血栓烷的產生。但是所有服用阿司匹林的患者都會被檢為COX-1被抑制，因此這2個試驗缺乏臨床特異性。

2.花生四烯酸被用作激活劑。花生四烯酸可以特異的誘導傳遞至COX-1(阿司匹林的抑制位點)的信號通路。但是阿司匹林抑制血小板的效應可能并不全因抑制COX-1導致［13］。以花生四烯酸作為誘導劑，許多試驗可被選擇用于阿司匹林抗血小板治療的監測。見表3。

3.PFA-100已被廣泛的用于研究阿司匹林抑制血小板的反應性。但是與前2種方法不同，PFA-100不是COX-1特異的。

(二)監測氯吡格雷的血小板功能試驗

有2類，見表4。

表4 監測氯吡格雷抗血小板作用的血小板功能試驗［14］

1.VASP-P試驗 只有VASP-P試驗對P2Y12受體信號通路特異。

2.ADP作為誘導劑的血小板功能試驗 需要注意ADP既與P2Y1受體結合也與P2Y12受體結合，而氯吡格雷的代謝活性物只與P2Y12受體結合。因此ADP誘導的血小板反應，既包括氯吡格雷抑制 P2Y12受體的效應，還包括 ADP激活P2Y1受體的效應。

(三)監測GPⅡb/Ⅲa拮抗劑的血小板功能試驗

有2類試驗。第一類，GPⅡb/Ⅲa拮抗劑阻滯了血小板聚集的最后共同通路，可通過很多血小板功能試驗監測，見表5。第二類，沒有整聯蛋白αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)的構象變化，血小板聚集就無法發生。因此采用流式細胞儀通過單克隆抗體PAC-1或配體誘導的結合位點測定血小板表面活化的GPⅡb/Ⅱa受體的變化也可以起到監測作用。

表5 監測GPⅡb/Ⅲa拮抗劑抗血小板作用的血小板功能試驗

(四)需要監測血小板功能的情況

在以下情況下可能需要監測血小板功能，見表6。

表6 臨床中可能需要監測血小板功能的情況

(五)理想血小板功能抑制水平

由于血小板檢測的是血小板的功能，而不是單一的物質，所以血小板功能的檢測方法不可避免的存在很大的變異。加之不同檢測方法的原理差異，檢測結果的單位也完全不同。所以不同方法之間的可比性仍是一個很大的問題。針對理想血小板抑制水平的研究，除了方法變異大的局限性外，仍缺乏大規模的前瞻性研究，而且不同研究之間的結果差異也較大［15-16］。目前不同實驗室使用理想血小板功能抑制水平大都是基于本實驗室的方法和服務人群的基礎上建立的。

四、小結與展望

由于血小板在動脈血栓形成起始步驟中的作用已被認識，所以在心血管事件一級預防和二級預防中血小板成為主要的抑制目標。傳統上，血小板活性測定一直被認為是一種診斷工具，用來評估出血性患者。然而，更快捷的、能迅速測定血小板性能的技術也為血栓形成前狀態的決策治療創造了機會。但是由于缺乏充分的循證醫學證據，依據血小板功能檢測結果調整抗血小板藥物劑量的指南和臨床預后仍處于缺乏狀態。

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