11C-Carfentanil的質量控制

張曉軍, 向曉輝, 張錦明 , 田嘉禾

(1.中國人民解放軍總醫院 核醫學科， 北京 100853;2.北京大學 神經科學研究所， 北京 100191)

11C-Carfentani是一種μ-Opiate受體(阿片受體)顯像劑，主要與涉及疼痛感覺的中樞神經Mm型μ-Opiate受體結合，描繪該受體在大腦內的分布[1]，研究該受體的藥理機制，探討針炙止痛的機理，也用于一系列中樞神經系統紊亂疾病如癲癇、肺腺癌等疾病的診斷，藥物成癮和煙酒戒斷治療等的監測[2-5]。卡芬太尼(Carfentanl)是目前最強有效的阿片類鎮痛藥物，藥物相對作用效價約為嗎啡的10 000倍，是芬太尼的100倍，在人體起效藥物劑量是10 μg[6-7]。

正電子放射性藥物，特別是短半衰期正電子核素標記的PET藥物，需要專門的安全評價和質量控制措施。短半衰期放射性藥物也必須在嚴格的時間內就地生產并就近使用，而且在生產和應用之間沒有足夠長的時間進行所有常規質量控制和檢測實驗。短半衰期放射性藥物的另一個特點是微量，11C-Carfentanil合成的前體去甲基卡芬太尼使用量是1 mg，產品中所含的11C-Carfentanil僅有幾十微克，這使得用于質量控制的分析方法必須具有較低的檢測下限，其中高效液相色譜法是最常用的一種分析手段，其與放射性探測器結合使用，可以測量產品的化學純度及放化純度，與標準品同時進樣可進行化合物的鑒定。

本研究利用高效液相色譜系統測量11C-Carfentanil注射液的化學純度和放化純度；液質聯用方法測量比活度；應用快速內毒素檢測器PTS檢測產品中內毒素含量，對制備的11C-Carfentanil注射液的質量控制方法進行了研究[8]。

1 實驗材料

液質聯用儀(LC-MS): API 2000，美國Applied Biosystems公司；Pump Agilent 1200 G1310，Agilent Eclipse XDB-C18分析柱(4.6 mm×150 mm×5 μm):Agilent Technologies公司；PTS(內毒素快速檢測儀)：美國charles river公司；Plus C18柱和 HPLC分析系統 (紫外檢測器和放射性探測器)：Waters公司；前體去甲基卡芬太尼，標準品12C-Carfentanil：德國ABX公司；KM小鼠：北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證編號：SKK京2009-0007)。

2 實驗方法

2.1 理化性質分析

2.1.1外觀鑒別11C-Carfentanil為本中心自行制備[9-10]，在制備完成后，11C-Carfentanil注射液在燈光下，在鉛玻璃后觀察。

2.1.2放射性核素鑒定 取1 mL制備的11C-Carfentanil注射液，用活度計測定60 min內不同時間的活度值，以時間為橫坐標，測量的濃度為縱坐標，在半對數坐標紙上作圖，用半對數法計算半衰期。

2.1.3酸堿度 使用精密pH試紙測定11C-Carfentanil注射液的pH。

2.1.4濃度測量 用HPLC系統測定11C-Carfentanil注射液的濃度，分析柱為Grace Alltima C18, 5 μL,10 mm×250 mm，流動相為500 mL含50 mmol乙酸銨的30%乙腈溶液，另加1 mL冰乙酸，pH 為6.4，流速1.0 mL·min-1。以紫外檢測器檢測，進樣量10 μL，檢測波長254 nm。使用面積歸一法測定11C-Carfentanil注射液的濃度。

2.1.5放化純度測量 測量HPLC條件與濃度測量相同。將11C-Carfentanil注射液與標準品(12C-Carfentanil)溶液(10 mg/L)在HPLC系統同時進樣，測量標準品和11C-Carfentanil注射液的保留時間；采用HPLC系統與在線放射性探測器結合測量，使用面積歸一法測定11C-Carfentanil注射液的放化純度。

2.2 比活度測量

11C-Carfentanil的比活度關系到研究與應用能否安全進行，需要嚴格控制。測量比活度需要先測量產品中11C-Carfentanil的濃度，濃度測量可采用紫外測量法和質譜測量法。

紫外測量方法為：精確配置5.0、7.5、10、15、20 mg/L標準品溶液，在上述色譜條件下，依次取10 μL進樣，對各濃度色譜峰面積積分，以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標進行線性回歸，得到定量線性方程。再取10 μL產品溶液進樣，將峰面積代入線性方程即可得到產品中卡芬太尼濃度。

質譜測量方法為：采用API2000質譜儀測量11C-Carfentanil注射液濃度，并計算其比活度。質譜參數設定：采用Q1 Full Scan模式，Syring Pump 進300 μg/L的標準溶液10 μL/min，根據Carfentanil的極性及其熱不穩定性，選用ESI離子源正離子掃描，可得395.3 amu為基峰，也是母離子(M+H)+，并Edit Ramp優化Declustering Potential(DP)為40 V、Focusing Potential(FP)為350 V、Entrance Potential(EP)為8 V。采用Product Ion Scan模式，掃描并選擇113.0 amu、246.3 amu、335.1 amu做子離子。進行MRM優化，設置離子對為395.3/113.0、395.3/246.3、395.3/335.1，同時Edit Ramp優化Collision Energy(CE)為50 V，Curtain Gas(CUR)為17 psig，Collision Gas為6 psig，IonSpray Voltage(IS)為5 500 V，Ion Source Gas 1(GS1)為55 psig，Ion Source Gas 2 (GS2)為55 psig，Temperature(TEM)為350 ℃，保存MRM方法。

質譜測量前液相色譜分離條件：HPLC采用Agilent Eclipse XDB-C18分析柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)，流動相為600 mL 50 mmol/L乙酸銨水溶液與400 mL乙腈混合，再加入2.2 mL冰乙酸調節pH至6.4，流速為500 μL/min。手動進樣20 μL，這種條件下，樣品中Carfentanil的保留時間為7.2 min。

精確制備濃度為100、200、300、400、500 μg/L的Carfentanil標準品溶液。應用設定好的質譜MRM方法，依次進樣25 μL，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標擬合線性回歸方程，再用25 μL產品進樣，經MS測量后依標準曲線即可計算出產品濃度，從而可計算出11C-Carfentanil的比活度。

2.3 生物學性質

2.3.1細菌內毒素含量 美國藥典26版規定，11C-Carfentanil注射液中細菌內毒素不高于175/V，內毒素單位(EU)(175/VIU)，V定義為最大總用藥劑量，以mL計。利用Charles river公司產品PTS檢測，取10 μL產品，加入注射用水稀釋到1 mL，即稀釋100倍，用專用微量進樣器取100 μL稀釋液加入PTS，即可測量稀釋100倍后產品中內毒素含量，求得產品內毒素含量。測量過程中所用器具和加入的試劑均為無菌無熱源。

2.3.2無菌檢查 根據中國藥典附錄[11]，取0.2 mL11C-Carfentanil注射液分別接種于7.5 mL硫乙醇酸鹽流體培養基和真菌培養基中，在隔離系統中30～35 ℃ 培養14 d，并按規定進行觀察。

2.3.3異常毒性檢查 根據中國藥典附錄方法[12]，用5只KM小鼠對生產的11C-Carfentanil注射液進行異常毒性檢查，每只小鼠尾靜脈注射0.2 mL 18.5 MBq產品溶液，載體為每只0.278 nmol。于注射后稱重，正常飼養一周后再次稱重，同時全部處死，取主要器官，肉眼觀察有無變化。

3 結果與討論

3.1 理化性質

11C-Carfentanil外觀為無色透明澄清溶液；精確pH試紙測量溶液的pH為5.5～6.0(n=3)；通過活度計測量產品衰變速度，用半對數法計算11C-Carfentanil注射液的半衰期，結果為20.3 min，符合11C放射性核素的半衰期要求。

經HPLC系統分析，11C-Carfentanil的紫外保留時間為5.3 min(圖1)，放射性峰的保留時間為5.8 min(圖2)，其時間差值是由于紫外探測器與放射性探測器之間的連接管路產生的。標準品與產品同時進樣，二者紫外保留時間一致，均為5.3 min，可以證實產品為目標化合物。采用放射流量檢測器測定產品放化純度，使用面積歸一法測定11C-Carfentanil注射液的放化純度>98%。

圖1 HPLC分析放射性峰

圖2 HPLC分析紫外峰

11C-Carfentanil溶液中主要化學雜質是去甲基卡芬太尼前體，合成結束時的反應溶液用10 mL 1%氨水稀釋后過C2柱，11C-Carfentanil被吸附在C2柱上，用10 mL水淋洗C2柱后，去甲基卡芬太尼前體即被除去，但仍有少量的前體與11C-Carfentanil隨乙醇淋洗到最終產品溶液中。去甲基卡芬太尼，在血液中無法進入血腦屏障(BBB)，動物實驗證實，盡管卡芬太尼的毒性很大，但其前體去甲基卡芬太尼則毒性很低，小鼠體內注射50 mg/kg的前體，沒有觀察到中毒征狀。因此微量前體對產品質量沒有很大影響[10]。

實驗中發現，在11C-Carfentanil的制備中，使用兩種不同的氫化鋰鋁對最終比活度的影響很大。使用高本底的氫化鋰鋁，由于其中12C甲醇鹽含量高，在與氫碘酸反應后生成12C-CH3I，轉換成12C-CH3-Triflate后與前體去甲基卡芬太尼反應生成12C-Carfentanil，因此使產品比活度大大下降。使用低本底與高本底的氫化鋰鋁進行反應，所得產品的比活度分別為1.69×1014Bq/g與3.48×1013Bq/g，可見，低本底的氫化鋰鋁化學純高，可以提高產品的比活度。

3.2 比活度測量

濃度為5～20 mg/L的Carfentanil標準品經HPLC檢測，定量標準曲線為y=516.81x-164.88，r=0.975 9，可見Carfentanil標準品濃度與HPLC紫外峰面積之間有良好的線性相關性。但產品溶液進樣后發現產品峰處雜峰較多，影響對11C-Carfentanil峰的峰面積進行積分，而導致無法對11C-Carfentanil準確定量。

質譜有靈敏、快速、特異、化學定量的特點，是目前定量化合物最靈敏最有效的方法。通過質譜定量分析11C-Carfentanil產品，記錄質譜圖示于圖3和圖4，經線性回歸，得到線性方程y=533x+5 370，r= 0.999 9，線性范圍為100～500 μg/L。在相同的質譜分析條件下，稀釋產品溶液，使其濃度落在標準曲線范圍內，然后取25 μL稀釋液進樣，測量質譜圖峰面積，即可知產品濃度為12.8 mg/L。再測量產品總活度，計算可得比活度為1.69×1014Bq/g。

圖3 母離子Q1掃描

圖4 離子對Q1/Q2掃描

3.3 生物學性質

內毒素快速檢測儀PTS的內置內毒素標準曲線范圍為5～0.05 EU/mL，產品稀釋100倍后測量內毒素含量為小于0.05 EU/mL，即產品中內毒素含量小于5 EU/mL(n=3)，符合標準。經無菌試驗證實產品為無菌溶液。

異常毒性檢查中，小鼠注射時體重均值為(23.1±1.8) g，一周后為(28.7±2.1) g，肉眼觀察主要器官，無變化。在保證所有合成材料與原料均為無菌無熱源的前提下，11C-Carfentanil注射液的細菌內毒素測量以及無菌檢驗可以在注射液使用中或使用結束后進行。

4 小 結

11C-Carfentani作為一種μ-Opiate受體顯像劑，由于其生理效應很強，要求產品高比活度。從理化性質和生物學性質兩個方面對11C-Carfentani進行質量控制，合成產品為無色透明澄清溶液，pH為5.5～6.0，半衰期為20.3 min，放化純大于98%，比活度為1.69×1014Bq/g，內毒素含量小于5 EU/mL，異常毒性試驗檢查合格。以上結果表明，11C-Carfentanil注射液的質量符合藥用要求，可滿足實驗和臨床安全使用的要求。

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