馬鈴薯卷葉病毒P0蛋白抑制RNA沉默及其與AGO蛋白的相互作用

霍曉輝 申永梅 劉國富 曹雪松

（聊城大學 生命科學學院，聊城 252059）

RNA沉默是一種由同源序列引起的特異RNA降解過程。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是近來發現的一種重要的基因沉默現象，通常由雙鏈RNA介導。1990年Napoli首次提出植物中的RNA沉默也稱為轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［1］。高等植物對于病毒侵染有保護自身的防御機制，當病毒侵染植物時，由病毒RNA和mRNA介導的轉基因會引起植物對病毒的抗性，稱為病毒介導的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）。它是轉錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）一種特殊形式。但是，為利于病毒侵染，植物病毒也同時編碼一種蛋白用來對抗RNAi，這類蛋白可以用于抑制RNA沉默的各個步驟，稱為 RNAi 抑制因子［2］。據報道已鑒定了50余種病毒編碼的RSS，例如馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）中的蚜傳輔助性蛋白酶（help component-proteinase，HC-Pro）［3］，黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）編碼的2b，馬鈴薯X 病毒（Potato virus X，PXV）編碼的p25、馬鈴薯卷葉病毒（Potato leafroll virus，PLRV）屬編碼的P0以及甘蔗黃葉病毒編碼（Sugarcane yellow leaf virus，SCYLV）的 P0 等［4］。

基因沉默抑制因子干擾基因沉默的機制有多種形式：抑制siRNA的積累；抑制因子與siRNA的結合，使之不能與蛋白核酸復合體結合形成RISC（RNA誘導的沉默復合物）；抑制雙鏈RNA的形成；抑制因子與基因沉默核酸蛋白復合體相結合，阻止轉錄后基因沉默的發生。AGO蛋白是RNA沉默途徑中一個關鍵蛋白，AGO蛋白可以與小RNA的引導鏈及其他蛋白質組裝形成的RNA誘導的沉默復合體（RISC）。病毒編碼的RSS與AGO相互作用的研究表明，AGO作為RNA沉默路徑當中的關鍵蛋白可能會成為很多病毒RSS作用的靶位點，AGO蛋白正確組裝成RISC需要多種dsRNA結合蛋白的協助，因此推測許多RSS利用其含有的“AGO 鉤”（GW/WG重復，甚至只含有單個GW或WG）與AGO的競爭性結合來抑制RNA沉默。最新研究發現，抑制因子中含有的重復甘氨酸、色氨酸（GW/WG motif）是與AGO相互作用的關鍵氨基酸，基因序列中GW/WG重復二次至多次可以作為“AGO鉤”（Ago hook）與AGO蛋白結合并在基因沉默中發揮作用［5，6］。例如蕪箐鄒縮病毒（TCV）外殼蛋白P38中的二個GW重復是與AGO相互作用的關鍵氨基酸，而且P38與AGO互作的同時會影響DCL的表達［7］。

馬鈴薯卷葉病毒屬于黃癥病毒科家族的馬鈴薯卷葉病毒屬中的黃化病毒組（Luteovirus），1916年被發現，是發現最早的馬鈴薯病毒，由多種蚜蟲以持久性方式傳播，而不能由機械傳播，PLRV的分布主要局限于在寄主植株韌皮部維管束內，主要侵染茄科（如馬鈴薯、番茄等）植物。據報道，在我國北方地區造成的馬鈴薯產量的損失約為30%-40%，嚴重時候可達到80%-90%。PLRV基因組結構為等軸對稱，直徑約24 nm。PLRV的RNA的堿基組成大體上為28%A、23%U、25%C與24%G。PLRV的基因組含有8個ORFs，其中有部分ORF重疊，在通過選擇性的識別起始密碼后再經過移碼、通讀終止密碼子及利用亞基因組等各種策略分別翻譯各 ORF［8］（圖 1）。P0是由 PLRV的 ORF1所編碼，它是病毒侵染植株后引起病癥的決定性因子，并且是一種RSS。

圖1 馬鈴薯卷葉病毒基因組結構

目前已鑒定的馬鈴薯卷葉病毒屬中的RSS只有馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、甜菜西方黃化病毒（BWYV）、南瓜蚜傳黃化病毒（CABYV）和甜瓜蚜傳黃化病毒（MABYV）編碼的P0蛋白，但對其機制都還不清楚，而我們試圖通過農桿菌瞬時表達滲透注射轉GFP基因的16c煙草葉片研究PLRV-P0是否能抑制RNA沉默。通過序列分析發現P0基因序列中含有兩個重復的WG基序，我們首先將P0基因序列中第87位和第140位的色氨酸（W）點突變為丙氨酸（A）（命名為P0WA），然后分別將P0和P0WA基因克隆到改造后的雙分子熒光互補載體pCAMBIA1300-CE上， 將 PLRV-P0，PLRV-P0WA分別和AGO共同進行農桿菌滲透注射野生型（N.ben）煙草葉片，并在熒光顯微鏡下觀察PLRV-P0和AGO及PLRV-P0WA和AGO共同注射后是否有綠色熒光的出現，從而確定PLRV-P0到底能否和AGO蛋白發生相互作用及其關鍵氨基酸。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本氏煙草（Nicotiana benthamiana）以及轉GFP基因的（16c）煙草種子由David Baulcombe教授惠贈。

1.1.2 菌種、質粒 大腸桿菌DH5α，農桿菌GV3101，pWEIMING101載體均由本實驗室保存，雙分子熒光互補載體pCAMBIA1300-CE以及重組質粒 ASK-NE，ASK-CE，AGO-NE，pGR107P0WA均由本實驗其他研究人員構建。

1.1.3 酶和試劑 限制性內切酶（XhoI，ClaI，SalI，KpnI）和T4 DNA連接酶購自Promega公司；TaqDNA聚合酶及其緩沖液，dNTP購自TakaRa公司；膠回收試劑盒，質粒快速提取試劑盒購自北京康潤誠業生物科技有限公司；DNA分子量標準購自Fermentas公司，其他生化試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據GenBank中報道的PLRV-P0的基因序列，設計合成含有相關酶切位點的上下游引物并由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 目的基因的PCR擴增

1.2.2.1 P0基因的PCR擴增 以pER8的cDNA為模 板，PLRV-P0 5'：GTTAGTCGACATGATTGTATTGACCCAGTCTG（下劃線為SalI酶切位點）；PLRVP0 3'：ACAGGGTACCTCATTCTTGTAATTCCTTTTGG（下劃線為KpnI酶切位點），1300-CE-P0 5'：GTTAATCGATATGATTGTATTGACCCAGTC（ 下 劃 線 為ClaI酶切位點）；1300-CE-P0 3'：CACACTCGAGTTCTTGTAATTCCTTTTGGA（下劃線為XhoI酶切位點）為引物進行PCR擴增。PCR反應體系為：pER8的cDNA 模板 1 μL，10 × PCR Buffer 5 μL（含 Mg2+），2.5 mmol/L 的dNTP 4 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，TaqDNA聚合酶 1 μL，Pfu 0.5 μL，加去離子水至總體積為50 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，共30個循環；72℃延伸5 min。然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 擴增產物，膠回收試劑盒切膠回收PCR產物并瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2.2 P0WA基因的PCR擴增 PLRV-P0的第87-140位氨基酸的原序列如下（方框內為兩個WG基序 ）：WGLLCGTHPAIQIVGLTIVIKLDDPTTAAAYRSELLRVSSSSYIQNAAGLSNGWG 。

以重組質粒pGR107P0WA為模板PCR擴增，將PLRV-P0的第87、140位的色氨酸（W）點突變丙氨酸（A），突變之后的序列如下（方框內為兩個WG基 序 突 變 后 ）：AGLLCGTHPAIQIVGLTIVIKLDDPTTAAAYRSELLRVSSSSYIQNAAGLSNGAG 。

以pGR107-P0WA質粒為模板，1300-CE-P0W-A 5'：GTTAATCGATATGATTGTATTGACCCAGTC（ 下劃線為ClaI酶切位點）；1300-CE-P0WA 3'：CACACTCGAGTTCTTGTAATTCCTTTTGGA（下劃線為XhoI酶切位點）為引物進行PCR擴增。PCR反應體系為：pGR107-P0WA質粒DNA模板1 μL，10×PCR Buffer 5 μL（含Mg2+），2.5 mmol/L的dNTP 4 μL，10 μmol/L上下游引物各 1 μL，TaqDNA聚合酶 1 μL，Pfu 0.5μL，加去離子水至總體積為50 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個循環；72℃延伸5 min。然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 擴增產物，膠回收試劑盒切膠回收PCR產物并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 植物表達載體的構建 將純化后的P0基因片段與質粒pWM101分別用限制性內切酶SalI和KpnI進行雙酶切；然后用限制性內切酶ClaI和XhoI對P0，P0WA基因進行雙酶切；最后用限制性內切酶ClaI，SalI對質粒載體pCAMBIA1300-CE進行酶切。酶切后產物用膠回收試劑盒進行回收，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產物，根據外源片段和載體DNA條帶亮度以等摩爾比例用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于含卡那霉素（Kan）的LB培養基平板上，37℃倒置培養12-16 h，挑取單菌落37℃恒溫振蕩培養12-16 h，以菌落為模板進行PCR擴增，根據菌落PCR結果對號提取重組質粒，然后進行質粒PCR和雙酶切鑒定，取1 mL菌液送交測序公司進行測序，測序結果與所設計的目的基因序列進行比對。

1.2.4 農桿菌的轉化 取5 μL重組質粒加入到100μL農桿菌GV3101感受態細胞中，用移液槍迅速吹打混勻后置于冰上3-5 min，然后把混合物貼著電擊杯壁緩慢加入，預激（參數：電壓2.2 kV，電容25μF，阻抗200 Ω）電激儀，再將電激杯至于電激儀中進行電激脈沖放電，電激結束后吸出電激混合液到微量離心管中，加入600 μL的LB液體培養基（含50 mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet），28℃條件下靜置3 h，室溫5 000 r/min離心5 min，取100 μL菌液涂布于LB固體培養基（含50 mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet）平板上，28℃倒置培養30-40 h，并對長出的菌落進行菌落PCR鑒定。

1.2.5 煙草的侵染 挑選5-6葉期的野生型煙草和轉GFP基因的16c煙草幼苗用于農桿菌的侵染。從LB（含 50 mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet）固體培養基上挑取重組單菌落，接種到5 mL的LB（50 mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet）液體培養基中，28℃，180 r/min恒溫振蕩培養24-28 h。按1∶100的比例把菌液轉接到20 mL的LB（50 mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet）液體培養基中，同時在培養基中加入終濃度為100 mmol/L的乙磺酸（MES）和終濃度為20 μmol/L的乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS），于28℃，180 r/min振蕩培養16-18 h，然后于4℃5 000 r/min離心5 min，棄上清，收集菌體。用農桿菌滲透緩沖液（含MES、AS、MgCl2，終濃度分別為100 mmol/L，20 μmol/L的和100 mmol/L）懸浮沉淀，稀釋至OD600nm值為1.0，室溫下靜置懸浮3 h，用已消毒的一次性注射器將農桿菌滲透液注射到煙草葉片葉脈的兩側，注射完畢后，將煙草置于28℃恒溫培養室中光照16 h，黑暗8 h培養。

1.2.6 煙草葉片的觀察 將煙草葉片放于暗室中用紫外燈照射觀察基因沉默現象并用相機拍照記錄。選取滲透注射過的煙草葉片，用剪刀沿葉脈剪下葉片。制作玻片標本：用潔凈的紗布把載玻片、蓋玻片擦拭干凈；在載玻片的中央滴一滴清水；用鑷子夾取葉片浸入玻片中央的水滴中；展平葉片；用鑷子夾取蓋玻片，使它的一邊先接觸載玻片上的水滴，然后輕輕蓋在葉片上。奧林巴斯BX51熒光顯微鏡觀察煙草葉片并拍照記錄。

2 結果

2.1 目的基因的PCR擴增

以pER8的cDNA為模板，PCR擴增PLRV-P0目的基因；以重組質粒pGR107P0WA為模板，PCR擴增PLRV-P0WA目的基因，1%瓊脂糖凝膠電泳結果（圖2）顯示，成功擴增出約為700 bp的片段，與預期結果大小一致。

2.2 植物表達載體的構建

圖2 P0（P0WA）基因的PCR擴增

將質粒載體pWEIMING101（SalI，KpnI），pCAMBIA 1300-CE（ClaI，SalI）和目的基因片段P0（SalI，KpnI；ClaI，XhoI），P0WA（ClaI，XhoI）進行雙酶切，然后用T4 DNA連接酶將載體和目的基因片段連接，轉化大腸桿菌DH5α得到重組質粒。經菌落PCR擴增檢測呈陽性的克隆分別提取質粒進行了質粒PCR，并對重組質粒pWEIMING101-P0（SalI，KpnI），pCAMBIA1300-CE-P0（P0WA）（ClaI，Sa lI）進行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜中呈現700 bp的目的基因條帶，與預期結果一致（圖3，圖4），測序結果表明插入片段長度為700 bp，與載體的連接方向正確，植物表達載體符合要求（圖5，圖 6）。

圖3 重組質粒pWEIMING101-P0雙酶切鑒定

圖4 重組質粒pCAMBIA1300-CE-P0（P0WA）雙酶切鑒定

圖5 pWEIMING101-P0植物表達載體的構建

2.3 PLRV-P0抑制RNA基因沉默

將重組質粒pWEIMING101-P0電擊轉化農桿菌GV3101，同時與GFP等體積混合共同滲透注射轉GFP基因的（16c）煙草葉片。單獨滲透注射含GFP基因的農桿菌菌液作為陰性對照，等體積混合滲透注射含GFP和T2b基因的農桿菌菌液作為陽性對照，暗室中紫外燈下觀察發現在滲透注射后的第6天等體積混合GFP和PLRV-P0的農桿菌菌液共同注射的煙草葉片中有很強的綠色熒光出現，而單獨滲透注射GFP的葉片中則沒有綠色熒光的出現（圖7）。研究表明PLRV-P0確實能抑制GFP mRNA引起的基因沉默。

為了保證試驗的可靠性，每個試驗組合滲透注射50片煙草葉片，并重復至少3次，共150片葉片，第6天在紫外燈下觀察并進行數據統計分析，如表1。經分析表明PLRV-P0能抑制GFP mRNA引起的基因沉默。

圖6 pCAMBIA1300-CE-P0（P0WA）植物表達載體的構建

圖7 PLRV-P0抑制RNA基因沉默的鑒定

2.4 PLRV-P0和AGO相互作用熒光觀察

利用農桿菌滲透注射技術把制備好的滲透注射液 分 別 以 ASK-NE+ASK-CE，P0-CE+AGO-NE，P0WACE+AGO-NE，P0-NE+AGO-CE，1300-CE+AGO-NE，1300-CE+1300-NE滲透注射液組合注射本氏（Nicoti-ana benthamiana）煙草葉片。注射完畢以后，將煙草置于28℃的培養室中進行培養。逐日獲取注射葉片在奧林巴斯BX51熒光顯微鏡下觀察。前期試驗過程中發現ASK-NE+ASK-CE滲透注射煙草的第2、3天能夠發出很強的熒光，因此這里用它作為陽性對照，為了排除了YFP的N末端和C末端單獨作用，設置了1300-CE+1300-NE為陰性對照。在滲透注射后的第24、36、48、60、72及96 h分別取材進行熒光顯微鏡觀察，通過觀察發現，在36 h時開始出現熒光，在48 h已經有大量熒光的表達，60 h仍然有熒光存在，但明顯不如48 h時亮，72 h時只有少量熒光表達（圖8）。每組試驗滲透注射10片葉片，重復至少3次，數據統計結果如表2所示，統計結果表明P0能夠與AGO1發生相互作用，產生熒光。在第48 h時對所觀察到的熒光用奧林巴斯BX51系統照相，ASK-NE+ASK-CE有大量的綠色熒光，說明試驗基本操作正確；P0-CE+AGO-NE有綠色熒光的出現，說明P0能夠和AGO蛋白發生相互作用；P0-CE+1300-NE、1300-CE+AGO-NE、1300-CE+1300-NE均沒有綠色熒光的出現，分別排除了P0和NE，AGO和CE，CE和NE相互作用的可能性。這些結果表明，PLRV-P0確實能夠和AGO蛋白發生相互作用。

表1 PLRV-P0抑制RNA沉默數據統計

圖8 PLRV-P0和AGO相互作用的熒光觀察

3 討論

目前已鑒定的馬鈴薯卷葉病毒屬中的RSS只有馬鈴薯卷葉病毒，甜菜西方黃化病毒，南瓜蚜傳黃化病毒和甜瓜蚜傳黃化病毒（MABYV）編碼的P0蛋白，但對其機制都還不清楚，而我們通過研究驗證了PLRV-P0確實能抑制RNA沉默。這對PLRVP0的抑制機制的研究有著重要的意義。

新近研究發現，一些抑制因子中含有的重復甘氨酸、色氨酸（GW/WG motif）是與AGO相互作用的關鍵氨基酸，序列中GW/WG重復二次至多次可以作為“AGO鉤”（Ago hook）與AGO蛋白結合并在基因沉默中發揮作用，這類抑制因子廣泛存在于酵母、植物和動物的細胞中［6］。例如，新近的研究發現蕪箐鄒縮病毒（TCV）外殼蛋白P38中的二個GW重復是與AGO相互作用的關鍵氨基酸，P38與AGO的相互作用同時影響DCL的表達［7］。我們通過序列分析首先發現，P0基因序列中含有兩個重復的WG基序，而WG基序可以作為AGO鉤和AGO蛋白結合，所以P0可能是通過與AGO結合抑制RNA沉默，熒光互作試驗結果證明，P0蛋白確實能夠和AGO蛋白發生相互作用，PLRV-P0的兩個重復的WG基序是其與AGO蛋白發生相互作用的關鍵氨基酸。

表2 滲透注射的煙草葉片出現熒光的時間

已有研究報道，有些病毒可以通過與AGO蛋白結合，并進一步作用于其下游的F-box泛素降解途徑，從而抑制RNA沉默。在PLRV-P0的研究中，我們已經證明了P0確實能和AGO蛋白結合，但究竟其是不是通過進一步作用于F-box泛素降解途徑還有待于進一步驗證。另外，我們試圖通過Pull down和Western blot分子驗證，證明PLRV-P0確實和AGO蛋白相互作用，并通過其結合抑制RNA沉默。但是，PLRV-P0蛋白和AGO相互作用觀察過程中，熒光顯微鏡下觀察到的熒光很少，提取的總蛋白中互作的蛋白也很少，因此Pull down 和Western blot檢測過程中還沒有得到預期結果，可能正是因為PLRV-P0和AGO結合后，作用于F-box泛素降解途徑引起了AGO的降解，所以才導致這種情況的出現。

4 結論

馬鈴薯卷葉病毒運動蛋白的P0蛋白是一個RNA沉默抑制因子，它可以抑制由GFP的mRNA引起的基因沉默；P0蛋白抑制GFP mRNA基因沉默的機制是通過與AGO蛋白的相互作用，其關鍵氨基酸是P0蛋白的WG基序。

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