抗生素耐藥性大腸桿菌外膜蛋白mOmpA N端序列分析

趙志平 聶鑫 李再新 丁杰 張智 謝萬如

近年來，抗生素耐藥大腸桿菌的種類和數量越來越多，并且具有抵抗多種抗生素的能力，如紅霉素、喹諾酮類和β-內酰胺類抗生素［1，2］。大腸桿菌的抗生素耐藥機制非常復雜，主要包括阻礙細胞壁和核酸合成、抑制蛋白質合成、破壞細胞膜結構等［3，4］。大腸桿菌外膜蛋白能保護細胞免受或減少多種有害物質的影響，如抗生素、蛋白酶和毒素等［5］。大腸桿菌外膜蛋白主要包括OmpA、OmpC和OmpF等，在影響抗生素等有害物質的通透性方面發揮著至關重要的作用。其中，OmpA是研究的最為透徹的大腸桿菌外膜蛋白［6］。

1998年，Pautsch 和 Schulz［7］最早通過 X-射線衍射技術確定了大腸桿菌OmpA的結構，并將研究結論發表在Nature Structural Biology雜志上。2001年，Arora等［8］利用核磁共振NMR技術研究了大腸桿菌OmpA的結構，相關研究成果也發表在Nature Structural Biology雜志上。研究發現，大腸桿菌OmpA外膜蛋白含有325個氨基酸殘基，包括N端和C端兩個區域。其中，N端區域包含171個氨基酸殘基，包含8個以β-折疊形勢存在的跨膜片段［9］。C端包含129個氨基酸殘基，含有較多的α-螺旋。N端和C端通過富含Ala-Pro鉸鏈序列相連［10］。

OmpA最早在大腸桿菌K12中被發現，隨后得到廣泛、深入的研究。OmpA屬于高豐度蛋白，每個細胞中含有約105個拷貝［11］。OmpA對外膜的結構整合和外膜蛋白的裝配、結構起著決定性作用［12］。OmpA可以作為抗菌素和細菌噬菌體受體、免疫靶點，并且和大腸桿菌的吸附和侵入密切相關［13］，在大腸桿菌接合轉移和生物膜形成過程中都發揮著重要作用［14］。OmpA N端區域對于OmpA的裝配、結構功能發揮著重要的作用。目前，尚無有關于OmpA N端序列突變的研究報道。

本研究從抗生素耐藥大腸肝菌中克隆mOmpA基因并構建表達載體pET32a-mOmpA，旨在為進一步了解大腸桿菌OmpA的結構功能及大腸桿菌耐藥機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 抗生素（氨芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素）耐藥大腸桿菌、DH5α和pET-32a載體為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和限制性內切酶 Hind III、EcoR I限制性內切酶、T4 DNA連接酶、PCR試劑等購自大連寶生物公司。DL2000 plus Marker為美科美（北京）公司產品，高保真Pfu DNA聚合酶購自Promega公司，質粒DNA抽提試劑盒和DNA過柱快速純化試劑盒購自Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 抗生素耐藥性大腸桿菌的分離 收集經病理學鑒定為大腸桿菌致死的兔子，無菌解剖，從腸道、肝臟及心臟中采集疑似菌染液，做倍比稀釋。將稀釋液均勻涂布在LB培養基平板上，37℃倒置培養，觀察細菌的形態特征。挑取生長良好的單個菌落，依次接種于伊紅美藍培養基平板和麥康凱培養基平板上，37℃倒置培養，觀察單個菌落的顏色、形態。最后挑取符合大腸桿菌形態特征的單個菌落接種于LB液體培養基中，37℃培養14-16h后，涂片、染色、鏡檢，確認為純培養物。

1.2.2 引物設計 根據GenBank報道的大腸桿菌OmpA基因序列（ID：7437746）設計mOmpA引物。mOmpA-F引物序列為：5'-GAATTCATGAAAAAGACAGCTATCGCG-3'（下劃線為EcoR I限制性酶切位點）。mOmpA-R引物序列為：5'-AAGCTTAGCCTGCGGCTGAGTTACAAC-3'（下劃線為Hind III限制性內切酶位點）。

1.2.3 煮沸法提取革蘭氏陰性細菌基因組DNA 將分離的抗生素耐藥大腸桿菌菌株劇烈振蕩過夜培養，取1mL菌液，離心棄上清；用1mL滅菌超純水漂洗2次，離心棄上清。用100μL滅菌超純水重懸，沸水煮6min，冰上放置5min。離心后將上清移入一干凈的1.5mL EP管中，即為總DNA，-20℃保存備用。

1.2.4 mOmpA的克隆 利用引物mOmpA-F和mOmpA-R從提取的基因組DNA中擴增mOmpA。PCR反應體系為：10×Pfu buffer 5μL，10μmol/L mOmpA-F引物 2μL，10μmol/L mOmpA-R引物 2μL，dNTP（各10mmol/L）1μL，基因組 DNA 10 ng-1μg，加滅菌超純水至50μL。PCR反應條件為：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 70s，30個循環。mOmpA大小為1100bp。

1.2.5 表達載體pET32a-mOmpA的構建 EcoR I和Hind III酶切mOmpA片段5h，利用過柱純化試劑盒回收；pET-32a經EcoR I和Hind III酶切后用同樣方法純化。取3.5μL雙酶切的mOmpA片段與1.5μL雙酶切的pET-32a于16℃連接過夜。連接產物加入到100μL DH5α感受態細胞中，冰水放置30min后42℃熱激90s，冰水放置2min。加入600μL LB培養基后于37℃孵育1h，取100μL培養液涂布在LB固體培養基（Amp 50μg/mL）上，37℃培養14-16h后進行菌落PCR驗證，PCR引物為mOmpA-F和T7 terminator。取陽性克隆進行擴大培養，提取質粒經EcoR I和Hind III酶切驗證后寄送深圳華大基因測序。

1.2.6 mOmpA N端序列分析 利用DNAMAN軟件對測序序列進行比對分析，利用Swiss-Model網站預測分析OmpA N端蛋白質結構。

圖1 mOmpA基因片段的PCR擴增

2 結果

2.1 mOmpA的克隆

利用高保真Pfu DNA聚合酶從提取的抗生素耐藥大腸桿菌基因組DNA中擴增了mOmpA片段，凝膠電泳得到了1100bp左右的明亮條帶（圖1），初步判斷PCR擴增正確。

2.2 表達載體pET32a-mOmpA的構建

EcoR I-Hind III雙酶切的mOmpA片段和pET-32a連接轉化后經PCR驗證獲得陽性克隆，如圖2所示。從圖2可以看出，以菌落2和4為模板擴增得到了1100bp左右的明亮條帶，100bp處條帶為引物二聚體。為進一步驗證表達載體的正確性，經培養后提取其質粒DNA，EcoR I和Hind III酶切后得到1100bp左右的目標片段，如圖3所示。

圖2 表達載體的菌落PCR驗證

圖3 表達載體的酶切驗證

2.3 mOmpA N端DNA序列比對分析

菌落PCR和EcoR I-Hind III酶切驗證正確的重組質粒DNA經深圳華大基因測序。將其N端序列與OmpA N端序列進行了比對分析，結果（圖4）顯示，mOmpA與OmpA N端的同源性為79.93％，發生了較大程度的突變。mOmpA N端長度是542bp，而OmpA N端長度為512bp，并且有兩處發生明顯突變，分別增加了15bp。

2.4 mOmpA N端氨基酸序列比對分析

mOmpA N端DNA序列翻譯成氨基酸序列后與OmpA N端序列進行了比對分析，結果如圖5所示。mOmpA與OmpA N端長度分別為181和171個氨基酸殘基，同源性為81.17％，有較多的氨基酸殘基發生了突變。OmpA N端含有8個β-折疊區域，mOmpA此區域有7個部位的氨基酸殘基發生了突變。其中，β1-折疊區域的Thr30和Ala32分別被Ala30和Gly32所取代。β3-折疊區域的Vla70、β4-折疊區域的Tyr93、β5-折疊區域的Thr127分別被Leu70、Phe93和Ser127所取代。β6-折疊區域的Asn135和Tyr150分別被Glu135和Trp150所取代。OmpA N端 含 有 4個 loop（L）環，mOmpA的L1和L3處發生了明顯變化，分別增加5個氨基酸殘基，它們分別是L1處的Gly43、Phe44、Tyr45、Gly46和 Asn47；L3處的 Tyr126、Asn127、Ser128、Thr129和Gly130。OmpA N端含有3個轉角（Turn），T1和T2沒有發生突變。T3發生3處突變，Ile152、Pro154和Glu155分別被Val152、Arg154和Asp155所取代。mOmpA N端氨基酸序列，尤其是β-折疊、Loop環和T轉角等重要區域氨基酸的突變對其空間結構可能產生一定的影響。

2.5 mOmpA N端空間結構預測

鑒于mOmpA的Loop環和轉角等重要區域發生突變，為預測其空間結構是否發生變化，使用了Swiss-Model在線工具對其進行了蛋白質空間結構預測，結果如圖6所示。從圖6可以看出mOmpA的L1、L2、L3和L4環的方向較OmpA都發生了明顯的變化。這些變化可能與Loop環部分氨基酸殘基發生突變有著密切關系。

3 討論

圖4 mOmpA和OmpA N端核苷酸序列比對分析

圖5 OmpA和mOmpA N端氨基酸序列比對分析

圖6 mOmpA和OmpA N端蛋白結構預測

OmpA是研究膜蛋白結構的模式蛋白，其N端區域的8個β-折疊區在其組裝過程中發揮著重要的作用［7，11］。mOmpA的 5個 β-折疊區發生了不同程度的突變，但蛋白質空間結構預測顯示β-折疊區的突變并未明顯改變其空間構型。mOmpA的T3轉角處發生了3處突變，這3處突變可能與mOmpA的Loop環的方向發生了顯著變化有關。OmpA在大腸桿菌抵御抗生素等有毒物質過程中發揮著重要的作用［5］，對其抵御脅迫條件同樣具有重要的作用［15］。OmpA N端氨基酸的突變是否會影響其功能以及其形成的膜孔通道還有待進一步試驗驗證。OmpA在致病性大腸桿菌進化和抗生素耐藥過程中發揮著重要作用。OmpA是普遍存在于革蘭氏陰性菌表面的蛋白，在細菌生命活動中發揮著至關重要的作用，它可以作為細菌的黏附素和侵襲素，參與生物膜的形成，也可作為多種噬菌體的受體，是先天免疫系統的重要靶位。因此，外膜蛋白的易突變性加大了致病性大腸桿菌的防治，增加了外膜蛋白疫苗的研制難度。

4 結論

本研究克隆了mOmpA，序列分析表明mOmpA N端DNA和氨基酸序列均發生了顯著突變。Swiss-Model分析顯示，mOmpA的N端空間結構發生了一定的變化，尤其是Loop環的方向發生了顯著變化。

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