鯉魚(yú)（Cyprinus carpio，Cyprinidae）ants基因及其對(duì)鱗片發(fā)育的影響

程安達(dá) 蔣麗 張保勇，3 王書(shū) 張研 劉永新方平 李恒德 孫效文，5

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院水產(chǎn)生物應(yīng)用基因組研究中心，北京 100141；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3. 大連海洋大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116023；4. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院學(xué)科發(fā)展處，北京 100141；5. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150070）

ants（adenine nucleotide translocators），又稱(chēng)為ATP/ADP載體，可以調(diào)節(jié)ATP和ADP在線粒體內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)，所以在真核細(xì)胞的能量代謝中扮演著重要的角色［1-3］。ants作為線粒體內(nèi)膜的組成部分，是線粒體中最豐富的一類(lèi)蛋白。在呼吸條件下，線粒體內(nèi)產(chǎn)生的ATP被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞活動(dòng)，作為交換，線粒體外部的ADP被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體內(nèi)，為在ATP合成酶的作用下ADP轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP提供底物。ants屬于線粒體載體家族（mitochondrial carrier family），這個(gè)家族可以進(jìn)行各種各樣的跨線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)［3，4］。

ant家族的蛋白是由核基因編碼的，表達(dá)之后定位到線粒體內(nèi)膜中。營(yíng)自由生活的細(xì)菌缺少與ant相似的分子，所以認(rèn)為ant蛋白是由真核起源的廣泛特異的載體家族進(jìn)化來(lái)的［5］。大多數(shù)真核生物，包括單細(xì)胞真核生物，都具有多個(gè)ant基因。例如，出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）有3個(gè)ant基因（ant1，ant2和ant3）可以編碼蛋白質(zhì)［6］。其中，ant2是最主要的同工型，無(wú)論是呼吸過(guò)程還是厭氧發(fā)酵過(guò)程，都是廣泛表達(dá)的［7］。ant1和ant3分別特異的在有氧和厭氧的條件下表達(dá)［6，8］。此外，ant2和ant3在丟失線粒體基因組的情況下仍能轉(zhuǎn)運(yùn)ATP來(lái)維持酵母的生存，而ant1則無(wú)此功能［9］。因此，不同的ant基因可能是被用來(lái)輸入和輸出ATP以有效地應(yīng)對(duì)外部的營(yíng)養(yǎng)和氧氣條件的變化。有趣的是啤酒酵母（S. cerevisiae）的ant1基因具有比ant2和ant3更高的堿基累計(jì)替換率［10］，這與ant1基因在復(fù)制之后發(fā)生了功能上的變化的觀點(diǎn)一致。

多細(xì)胞生物體中，在不同類(lèi)型的組織，不同的發(fā)育時(shí)期以及不同的細(xì)胞增殖狀態(tài)下，ant基因的表達(dá)都是不同的。大多數(shù)脊椎動(dòng)物都可以表達(dá)3個(gè)不同的旁系同源的ant基因，它們表現(xiàn)出較高程度的序列相似性。其中，ant1（Slc25a4）主要在心臟和骨骼肌中表達(dá)，可以假定它可以適應(yīng)心臟和骨骼肌中 ATP的快速代謝［11］。ant2（Slc25a5）和ant3（Slc25a6）在軀體組織中廣泛表達(dá)，然而，ant2在哺乳動(dòng)物快速生長(zhǎng)的細(xì)胞中表達(dá)量較高，是有變化的，而ant3似乎是在所有組織中組成性的表達(dá)，其表達(dá)量無(wú)太多變化［12，13］。嚙齒類(lèi)動(dòng)物缺少ant3基因，其ant2基因很可能同時(shí)承擔(dān)了人類(lèi)上ant2和ant3基因的功能［14，15］。在哺乳動(dòng)物中，還存在第4種ant家族基因ant4（Slc25a31），它是在人和小鼠中首先被發(fā)現(xiàn)的［16-18］。它可以選擇性地在成熟哺乳動(dòng)物的睪丸和精子中表達(dá)，且在小鼠（mouse）精子發(fā)生過(guò)程中是必需的，但在鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、蛙中卻是缺少的［19］。ant4可以在成熟小鼠睪丸中的生殖細(xì)胞中特異表達(dá)，且在減數(shù)分裂時(shí)期，其表達(dá)量特別的高［20］。

鱗的形成是個(gè)極其復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，可能需要成千上萬(wàn)的基因參與其中。ant作為ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可以為各個(gè)細(xì)胞的活動(dòng)運(yùn)送能量，它在鱗形成過(guò)程中可能發(fā)揮必不可少的作用。為了研究鱗形成的分子機(jī)制，我們利用Genefishing技術(shù)特異地釣取了鯉皮膚組織中的ant基因，經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序鑒定并進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析來(lái)解析ant基因的基本特征，并通過(guò)原位雜交技術(shù)對(duì)該基因在鱗被形成過(guò)程中的表達(dá)進(jìn)行分析，以此證明ant基因與鱗被發(fā)育的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

用于提取RNA的鯉魚(yú)樣品以及用來(lái)做原位雜交的幼魚(yú)都來(lái)自于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所松浦實(shí)驗(yàn)基地和無(wú)錫淡水研究中心。提取RNA的鯉魚(yú)樣品用新鮮的鯉魚(yú)皮膚組織，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自東洋紡（Toyobo）公司。

1.2 方法

1.2.1 ant基因的釣取 利用Genefishing（Seegene，Korean）試劑盒對(duì)全鱗的普通鯉魚(yú)建鯉（Common Carp）和普通鯉魚(yú)天然選擇突變體德國(guó)鏡鯉（Germany Mirror Carp）的皮膚進(jìn)行總RNA的差異篩選，試驗(yàn)步驟參照試劑盒的protocol。

1.2.2 ant基因CDS全長(zhǎng)的克隆 刮掉鯉魚(yú)的鱗片，取100 mg皮膚組織，用Trizol法提取RNA，DEPC水溶解RNA，利用分光光度計(jì)測(cè)定所提RNA的OD260/OD280值來(lái)判斷RNA的質(zhì)量，調(diào)節(jié)RNA的濃度為1 μg/μL，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的完整性。按照東洋紡RNA反轉(zhuǎn)試劑盒的說(shuō)明操作反轉(zhuǎn)RNA為第一鏈cDNA。

根據(jù)斑馬魚(yú)ant基因的mRNA序列在5'UTR和3'UTR的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)目的片段包含CDS全長(zhǎng)的上下游引物（Forward 5'-3'：CATTTCGAATCAGCCGGCATTC Reverse 5'-3'：GAAAACAGGTAGATTTTAGTAC），以反轉(zhuǎn)得到的鯉魚(yú)第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；54℃退火30 s；72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物凝膠電泳后利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，與EZ-T Vector連接，并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后，委托美吉公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息分析 將測(cè)序獲得的mRNA序列，利用NCBI上的ORF Finder預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框，以確定其起始密碼子和終止密碼子位點(diǎn)，從而獲得CDS全長(zhǎng)序列。利用MEGA5軟件對(duì)測(cè)序得到的多條CDS序列進(jìn)行ClustalW比對(duì)。利用MEGA5軟件將CDS序列翻譯成氨基酸序列，對(duì)其進(jìn)行比對(duì)。從NCBI網(wǎng)站下載的不同分類(lèi)地位的其它物種ant基因的氨基酸序列與測(cè)序得到的ant氨基酸序列一起利用MEGA5的鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析。

1.2.4 原位雜交檢測(cè)基因在皮膚中的表達(dá)

1.2.4.1 反義RNA探針的制備 利用PrimerPremier5.0軟件在該基因mRNA的特異區(qū)域設(shè)計(jì)片段長(zhǎng)度為200 bp左右的一對(duì)引物（Forward 5'-3'：TGGGTAACTGCTTGGTGAAGATCTCC Reverse 5'-3'：ACCAGCAACAGCAGTCACAGTCTGA），以反轉(zhuǎn)得到的鯉魚(yú)第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；66℃退火30 s；72℃延伸15 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與EZ-T Vector連接，并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，鑒定目的片段插入方向。根據(jù)插入方向，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行線性化酶切（10 μg），選擇T3或T7啟動(dòng)子進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。若反向插入，用下游NotⅠ酶切位點(diǎn)酶切，用T7啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄。若正向插入，用上游XhoⅠ酶切位點(diǎn)酶切，用T3啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄。以線性質(zhì)粒為模版，體外合成地高辛標(biāo)記RNA探針。20 μL反應(yīng)體系如下：線性化模版DNA 1 μg，T3或T7 RNA聚合酶1 μL，RNase Inhibitor 1 μL，DIG-RNA dNTP 2 μL，5×Buffer 4 μL，去 RNase 水補(bǔ)充到 20 μL，37℃水浴2 h，稍離心后加1 μL DNaseⅠ37℃水浴20 min。取0.5 μL，進(jìn)行電泳鑒定探針是否合成出來(lái)。用試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行產(chǎn)物純化，純化后的RNA probe 稀釋到HYB+（稀釋濃度，不同基因，所需probe不同。一般是20℃洗脫，1∶100稀釋?zhuān)糜谠浑s交。制備正義RNA探針作為對(duì)照，其線性化酶切位點(diǎn)和體外轉(zhuǎn)錄方向的選擇與反義探針的制備正好相反。

1.2.4.2 原位雜交所用魚(yú)的飼養(yǎng)和前期處理 孵化黑龍江水產(chǎn)研究所松浦實(shí)驗(yàn)基地的人工授精的鯉魚(yú)卵，開(kāi)口餌料為草履蟲(chóng)，逐漸過(guò)渡到鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體和鯉魚(yú)顆粒飼料喂養(yǎng)幼魚(yú)，直到剛開(kāi)始產(chǎn)生鱗片。收集剛開(kāi)始產(chǎn)生鱗片的幼魚(yú)，置于冰上將其殺死，利用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，4℃過(guò)夜，逐漸過(guò)渡到無(wú)水甲醇中脫水，在甲醇中-20℃過(guò)夜。

1.2.4.3 原位雜交的步驟 原位雜交參照Westerfield［21］和 Jowett［22］所敘述的方法。將幼魚(yú)從甲醇中逐漸過(guò)渡到PBST（DEPC水配制）溶液中，置換成HYB-溶液65℃水浴30 min，置換成HYB+溶液65℃預(yù)雜交6 h以上。置換成加入探針的HYB+溶液，65℃雜交15 h。回收探針，-70℃保存。在65℃下清洗幼魚(yú)，洗去多余的探針，50%甲酰胺/2× SSCT 2次，每次1 h，2 X SSCT 1次，15 min，0.2 ×SSCT洗2次，每次1 h。室溫下，用MABT洗3次，每次10 min，加入封閉液室溫緩慢搖動(dòng)封閉2 h。更換新鮮的封閉液，按1∶3 000比例加入耦聯(lián)堿性磷酸酶的抗地高辛抗體（Anti-digoxigenin-AP Fab fragments），4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。半對(duì)照不加入探針，但加入抗體，空白對(duì)照不加抗體。用含10%滅活羊血清的MABT緩慢搖動(dòng)50 min，用MABT清洗3次，每次時(shí)間為2 h。用染色緩沖液（Staining buffer）平衡3次，每次10 min。加入含5 mmol/L左旋咪唑的顯色液BM Purple AP Substrate，避光室溫顯色。根據(jù)具體情況，每隔一段時(shí)間觀察幼魚(yú)皮膚的顯色情況。待顯色完全后，用PBST洗3次，每次10 min，再用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定20 min。用PBST洗去多聚甲醛后置換成90%的甘油進(jìn)行拍照，4℃保存。

2 結(jié)果

2.1 Genefishing技術(shù)釣取鱗片發(fā)育相關(guān)基因

利用Genefishing試劑盒中的20對(duì)引物對(duì)兩組鯉魚(yú)樣品進(jìn)行差異篩選，得到表達(dá)差異的片段后進(jìn)行克隆測(cè)序。如圖1所示，總共得到了7個(gè)差異產(chǎn)物（展示部分圖）。用試劑盒中所帶的簡(jiǎn)并引物ACP28在德國(guó)鏡鯉中擴(kuò)增出了一個(gè)約500 bp的特異條帶，但同時(shí)在建鯉中是沒(méi)有表達(dá)的；利用ACP29在鏡鯉中擴(kuò)增出了一個(gè)差異于建鯉的約700 bp的條帶（其他未展示的幾組引物篩選出來(lái)的差異表達(dá)產(chǎn)物在此不作介紹）。經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序鑒定，其中ACP28擴(kuò)增出的產(chǎn)物是ant基因表達(dá)產(chǎn)物。

2.2 ant基因全長(zhǎng)CDS的克隆和序列分析

圖1 Genefishing篩選建鯉和鏡鯉的皮膚總RNA的反轉(zhuǎn)產(chǎn)物cDNA

提取鯉魚(yú)皮膚組織的RNA，利用東洋紡反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)合成第一鏈cDNA，以cDNA為模板，利用包含基因CDS全長(zhǎng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、克隆培養(yǎng)、挑取多個(gè)克隆測(cè)序，經(jīng)ClustalW比對(duì)得到6條不同的CDS全長(zhǎng)序列，分別表示為 CDS1、CDS2、CDS3、CDS4、CDS5和CDS6（圖2）。利用NCBI上的ORF Finder預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框，發(fā)現(xiàn)ants基因CDS全長(zhǎng)897 bp，可編碼298個(gè)氨基酸。利用MEGA5軟件將CDS序列翻譯成氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有4條不同氨基酸序列，分別為a、b、c和d，其中CDS1、CDS5和CDS6編碼相同的氨基酸序列a，而CDS2、CDS3和CDS4分別編碼序列b、c和d。它們是高度保守的，但是仍存在部分差異（圖3），兩兩相似性達(dá)到98%-99%，這些高度保守的相似性很高的類(lèi)似蛋白很可能是由同一個(gè)基因同源分化來(lái)的，需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。物種間構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鯉皮膚中ant基因的氨基酸序列與斑馬魚(yú)ant2最為接近，說(shuō)明由鯉魚(yú)皮膚中釣取的ant基因是ant2的可能性較大。由圖4聚類(lèi)的結(jié)果（方框部分）可以看出，哺乳動(dòng)物中的人（human），牛（bovine），小鼠（mouse）和大鼠（rat）的ant2親源關(guān)系比較近，而與魚(yú)類(lèi)中的河豚（fugu），斑馬魚(yú)（zebrafish）和鯉相距較遠(yuǎn)，這也是符合進(jìn)化關(guān)系的。

2.3 ant基因在皮膚中的表達(dá)

利用整體原位雜交的方法，制備地高辛標(biāo)記的反義RNA探針，與皮膚中的mRNA進(jìn)行特異雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ant基因在即將產(chǎn)生鱗片的皮膚處特異表達(dá)（圖5 -H），表明ant基因參與到鱗的形成過(guò)程中。ant基因在鯉正在產(chǎn)生鱗片的皮膚處表達(dá)明顯增強(qiáng)（圖5 -H），而在皮膚的其它部位則表達(dá)較弱或不表達(dá)，正義探針作為負(fù)對(duì)照中沒(méi)有雜交信號(hào)（圖5- I），這個(gè)結(jié)果表明ant2基因可能在鱗片發(fā)生及其維持過(guò)程有重要作用，這與ant2在哺乳動(dòng)物快速生長(zhǎng)的細(xì)胞中表達(dá)量較高，且有變化的［12，13］觀點(diǎn)一致。ant是一種線粒體中含量十分豐富的能量轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白，它可以將線粒體產(chǎn)生的ATP運(yùn)出，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量。由此可以推測(cè)，ant基因在鱗片部位的表達(dá)可能是與鱗被形成過(guò)程中，產(chǎn)生鱗片的細(xì)胞或者維持鱗片發(fā)育的皮膚細(xì)胞由于其生理活動(dòng)的加強(qiáng)而需要更多的能量有關(guān)，從而需要較多的能量載體蛋白，而這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白本身具有特異性。

圖2 建鯉皮膚中釣取的6條不同的ants基因CDS全長(zhǎng)序列

圖3 建鯉皮膚中釣取的4條不同的ants基因氨基酸序列

圖4 建鯉中釣取的4條氨基酸序列與其它物種ants序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)

圖5 原位雜交檢測(cè)ANTs基因在不同時(shí)期胚胎和幼魚(yú)皮膚中的表達(dá)

在我們的研究中，利用Genefishing技術(shù)采用多對(duì)特異的簡(jiǎn)并引物對(duì)一組有鱗和散鱗的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的差異篩選，用40對(duì)引物（該文中未展示）共得到了40個(gè)差異轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，我們將對(duì)其逐一進(jìn)行功能解析，本研究中為ant基因。為了驗(yàn)證Genefishing的效率，把篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因返回到德國(guó)鏡鯉和建鯉中進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證（圖6），證明陽(yáng)性率可達(dá)90%（40/44）。因此Genefishing篩選差異基因具有陽(yáng)性率高，篩選效率高的特點(diǎn)。

3 討論

圖6 RT-PCR驗(yàn)證差異產(chǎn)物在德國(guó)鏡鯉和建鯉中的表達(dá)情況

鱗片作為皮膚重要的附屬物，與哺乳動(dòng)物的毛發(fā)、指甲等一樣，是由皮膚原始干細(xì)胞經(jīng)過(guò)定向分化而來(lái)，具有重要的生物學(xué)意義。魚(yú)類(lèi)的鱗片除了減少游動(dòng)產(chǎn)生的摩擦力、維持體型骨架的基本功能之外，同時(shí)還具有很重要的防御病原菌侵害的功能。根據(jù)鱗片的形態(tài)不同，可以將魚(yú)類(lèi)的鱗片分為楯鱗，硬鱗和骨鱗，其中骨鱗又分為圓鱗和櫛鱗，這些形態(tài)各異的鱗片的發(fā)育都是有其固定的模式，這就是我們所說(shuō)的鱗片的模式形成和形態(tài)建成。鱗片發(fā)生及發(fā)育的分子機(jī)制一直以來(lái)是水產(chǎn)生物學(xué)家非常感興趣的生物學(xué)問(wèn)題，但由于魚(yú)類(lèi)的研究囿于其基因組相對(duì)龐大，基因組成比較復(fù)雜，進(jìn)化上較為古老等原因一直比較落后。迄今為止，已經(jīng)克隆并且證實(shí)與魚(yú)類(lèi)的鱗片發(fā)生及發(fā)育相關(guān)的基因比較有代表性的有 fgf/fgfr［21］，apoE［22］，EDA/EDAR［23，24］，SHH［25，26］等，而且他們利用的是傳統(tǒng)的分子遺傳學(xué)方式篩選出了鱗片發(fā)育紊亂的突變體，該種方法準(zhǔn)確但是通量較低，而且由于魚(yú)類(lèi)多倍體的特征，使得突變表型由于冗余或者相同基因功能的互補(bǔ)而不能快速地定位鱗被相關(guān)基因。目前得益于測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展尤為迅速而且價(jià)格低廉，我們可以從轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)物為突破口，高通量、快速地挖掘鱗被相關(guān)因子，然后進(jìn)行功能研究，不失為一種高效的策略。

我們特異地從皮膚中釣取ant基因，進(jìn)行多次測(cè)序，最終得到了4條不同的氨基酸序列，它們氨基酸差別不大，有的甚至只相差一個(gè)氨基酸。經(jīng)簡(jiǎn)單的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)它們與斑馬魚(yú)ant2基因的相似性最高，猜測(cè)它們很可能同屬于ant2，它們之間的不同可能是由堿基突變或SNP造成的。由進(jìn)化樹(shù)可以看出哺乳動(dòng)物以及鳥(niǎo)類(lèi)等高等脊椎動(dòng)物的ant基因歸類(lèi)明顯，而魚(yú)類(lèi)與其相比，顯得有些混亂，盡管如此，可以明顯地發(fā)現(xiàn)鯉皮膚中釣出的ant基因明顯的與斑馬魚(yú)ant2基因歸在一起，所以是ant2的可能性最大。

釣取皮膚中的ant基因，雖然得到4條不同的氨基酸序列，但是它們的相似度極其的高，很可能都屬于ant基因。在哺乳動(dòng)物中ant3基因廣泛表達(dá)。由此推知ant3在鯉魚(yú)的皮膚中很可能也是表達(dá)的。但是卻沒(méi)有被釣出，一方面可能是由于挑取測(cè)序的克隆較少，沒(méi)有達(dá)到飽和，所以漏掉了某些ant基因；另一方面可能是ant3確實(shí)不在皮膚處表達(dá)，則說(shuō)明鯉魚(yú)與哺乳動(dòng)物中的ant基因特化的程度差別很大。斑馬魚(yú)是二倍體魚(yú)類(lèi)，而鯉魚(yú)是經(jīng)過(guò)了四倍體的二倍體化的過(guò)程，鯉魚(yú)的染色體數(shù)是斑馬魚(yú)的兩倍。目前斑馬魚(yú)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有3個(gè)ant基因，分別是ant1、ant2和ant3。由此推測(cè)，若是將鯉魚(yú)中的ant基因全部找出，很可能是6條或者是更多。

經(jīng)整體原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ant基因確實(shí)在正要產(chǎn)生鱗片的皮膚處高表達(dá)，而在其它部位則表達(dá)較弱或不表達(dá)，說(shuō)明ant基因確實(shí)是在鱗形成的過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用。由于ant基因序列的相似度太高，無(wú)法用原雜的方法區(qū)分參與到鱗形成過(guò)程的是ant基因的哪一個(gè)同工型；但是，通過(guò)原雜發(fā)現(xiàn)在皮膚中ant基因的表達(dá)有強(qiáng)弱變化。在形成鱗的部位ant的表達(dá)量要明顯高于還未生長(zhǎng)鱗的部位，這與ant2的特點(diǎn)相符。ant2在哺乳動(dòng)物快速生長(zhǎng)的細(xì)胞中表達(dá)量較高，且有變化，而ant3似乎是在所有組織中結(jié)構(gòu)性的表達(dá)，其表達(dá)量無(wú)太多變化［12，13］，所以，參與到鱗形成過(guò)程中的ant基因很可能是ant2。在鱗形成過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖等生命活動(dòng)較旺盛，需要更多的能量供應(yīng)，也就需要表達(dá)更多的ant基因來(lái)提供足夠的ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)載體。另外，ant2除了在鱗片著生部位強(qiáng)烈特異表達(dá)之外，在受精后10 h的外包處開(kāi)始強(qiáng)烈特異表達(dá)，以后的表達(dá)逐漸減弱至無(wú)，而后又在受精后48 h的體節(jié)中特異超強(qiáng)表達(dá)，這些結(jié)果說(shuō)明ant2在體節(jié)發(fā)育中的功能是通過(guò)其精確受控的時(shí)空表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié)論

ants基因在建鯉（全身被鱗）和德國(guó)鏡鯉（部分被鱗）兩種魚(yú)的皮膚處表達(dá)存在顯著差異，說(shuō)明ants基因很可能與鱗被的形成發(fā)育相關(guān)。

利用RT-PCR技術(shù)對(duì)其皮膚中的ants進(jìn)行釣取，得到6條不同的ants的CDS序列，分別編碼4條不同的蛋白產(chǎn)物。4個(gè)ants表達(dá)產(chǎn)物與斑馬魚(yú)ant2基因最為相似，且明顯聚類(lèi)為ant2，說(shuō)明皮膚中表達(dá)的這些ants很可能是ant2。

ant2在受精后4.5 h和6 h不表達(dá)，從受精后10 h開(kāi)始在外包處強(qiáng)烈特異表達(dá)，在受精后12 h的胚胎中很弱表達(dá)，在受精后24 h的體節(jié)中特異強(qiáng)烈表達(dá)，在受精后48 h胚胎無(wú)表達(dá)，但是在著生鱗片的部位特異強(qiáng)烈表達(dá)，而在皮膚的其它部位則表達(dá)較弱或者不表達(dá)。說(shuō)明ant2基因確實(shí)與鱗被的形成和發(fā)育有關(guān)。

以上的結(jié)果表明，ant2基因可能是通過(guò)不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（isoforms）在精細(xì)調(diào)控鱗片的發(fā)育。

致謝：本研究所用試驗(yàn)材料得到無(wú)錫淡水研究中心俞菊華研究員、黑龍江水產(chǎn)研究所張曉鋒和曹頂臣副研究員的幫助，原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)受到中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物所王強(qiáng)研究員的幫助，在此一并表示感謝。

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