TRIP-1抗體的制作及應用

張宏玲 萬駿 董一辰 曹威 張新勝 張錦勰 黃來強

（1. 清華大學生命科學學院，北京 100084；2. 清華大學深圳研究生院生命與健康學部生物醫藥研究中心和基因與抗體治療重點實驗室，深圳 518055）

TRIP-1（transforming growth factor-β receptor interacting protein）最初是在B細胞文庫中使用酵母雙雜交的方法，利用TGFβRⅡC端作為誘餌蛋白，發現的一個含有5個WD40重復結構域的蛋白，分子量為36 kD［1］。TRIP-1可以被TGFβ二型受體磷酸化。TRIP-1是TGFβ信號通路的調節子，可以抑制TGF-β所調控的血漿纖維蛋白溶酶原激活抑制因子-1（PAI-1）基因轉錄［2］，細胞遷移，表皮間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［3］和骨細胞的分化中起重要的調控作用［4，5］。TRIP-1也是一個與癌癥密切相關的蛋白，被發現在多種癌癥中高表達。另外，TRIP-1可作為eIF3i蛋白存在細胞內行使蛋白質翻譯功能［6，7］。目前，TRIP-1的功能仍然還不很清楚。

抗體是研究蛋白功能至關重要的工具。TRIP-1蛋白被克隆17年以來，相關的研究文獻并不多見，直到近兩年才出現TRIP-1商業化抗體，但商業化抗體用量有限且價格昂貴。為了便于后續研究，本實驗室通過動物免疫來生產大量TRIP-1特異抗體。首先，通過RT-PCR獲得TRIP-1基因，并將其克隆到原核表達載體pET-His中，IPTG誘導表達TRIP-1蛋白。將誘導所得蛋白純化后對試驗動物進行免疫，一段時間后獲取抗血清，經效價測定及純化，制造的抗體用于Western blot和免疫熒光等試驗，旨在為進一步研究該蛋白在真核細胞內的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒pET-His-TRIP-1，重組大腸桿菌E. coliBL21（DE3）（攜帶質粒 pET-His-TRIP-1）為本實驗 室 構 建 和 保 存 ；HeLa、HepG2、HEK293、CNE、NIH3T3細胞為本實驗室儲存；用于飼養哺乳動物細胞的DMEM培養基購自Gibico公司；新西蘭大耳兔、昆明鼠購自廣州實驗動物中心；蛋白質marker購自Fermentas公司；HRP酶標二抗（抗鼠和抗兔）和FITC標記的二抗購自KPL公司，鬼筆環肽購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 TRIP-1蛋白原核誘導表達及純化 隨機挑取單克隆接種于5 mL含適量抗生素LB液體培養基中，于37℃、200 r/min條件下過夜培養。然后按2%接種量接種于200 mL含抗生素新鮮的LB液體培養基中，于37℃、200 r/min條件下繼續培養。菌液濃度達OD600=0.6時加入終濃度0.2 mmol/L IPTG，37℃、200 r/min條件下培養。IPTG誘導5 h，5 000 r/min離心5 min，收集菌體，用40 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液混合重懸，冰上進行超聲處理。5 000 r/min離心，根據蛋白表達情況分別收集上清，沉淀。

1.2.2 包涵體的洗滌和純化 由于TRIP-1蛋白在包涵體中，本研究采用尿素法純化包涵體［8］，具體純化方法如下：Ni-NTA His Binding·Resin 2 mL柱預處理：用5 mL去離子水洗滌；加0.5-1 mL NiSO4；再用5 mL去離子水洗滌。用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）+8 mol/L尿素平衡柱。上樣準備好的包涵體溶液［20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）+6 mol/L尿素溶解］，收集流出液。用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L 咪唑，1 mmol/L β-巰基乙醇（pH8.0）+8 mol/L尿素洗滌，收集流出液。用30 mL 20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L咪唑，1 mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0洗滌，收集流出液。用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L imidazole，1 mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0洗脫蛋白，收集1 mL/管，蛋白在此步收集。最后用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L咪唑，1 mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0洗滌，收集流出液。用10 mL去離子水洗滌柱子，充滿20%乙醇，放在4℃冰箱保存。純化的蛋白用SDSPAGE電泳檢測。

1.2.3 TRIP-1兔抗血清制備 取2 mL TRIP-1蛋白（1.6 mg/mL）制品與等體積的弗氏完全佐劑（Freunds Adjuvant，complete）混合，在新西蘭大耳兔背部選取4-6個點進行皮下多點接種，共接種4次，每次間隔14 d，第4次加強免疫后7 d耳緣靜脈采血，分離血清，進行效價檢測，獲陽性結果后進行心臟取血，將血液收集到無菌的試管中，室溫靜置1-2 h，待血液凝固后轉移到4℃冰箱中，放置過夜，至血清析出，將血清轉移到無菌的離心管中，10 000 r/min、4℃離心30 min，取上清，保存于-70℃備用。

1.2.4 TRIP-1鼠抗血清制備 5只3-4周齡昆明小鼠，將200 μg抗原蛋白溶于250 μL生理鹽水并與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，對小鼠進行皮下注射。首次免疫2周后進行第2次免疫，免疫原劑量減半，并用弗氏不完全佐劑乳化。第2次免疫后每隔7 d按照第2次免疫的方法繼續免疫，第4次免疫之后第3天，尾部取血分離血清，進行效價檢測，獲陽性結果后，進行心臟取血，將血液收集到無菌的試管中，室溫靜置1-2 h，待血液凝固后，轉移到4℃冰箱中，放置過夜，至血清析出，將血清轉移到無菌的離心管中，10 000 r/min、4℃離心30 min，取上清，保存于-70℃備用。

1.2.5 ELISA檢測抗血清效價 抗原包被：將抗原用包被液1∶4 000稀釋（10 μg/mL終濃度），100 μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板中，4℃放置過夜。洗滌：次日傾去凹孔內的液體，PBST洗3次。封閉：加100 μL/孔3% BSA，室溫放置0.5 h。洗滌：用PBST洗3次。

加待測樣品（一抗）：將抗體血清在另一塊板上用PBS連續稀釋，100 μL/孔加到已包被的板上，每個樣品平行做兩份，免疫前的血清作為陰性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1 h。洗滌：用PBST洗3次。

加HRP酶標二抗：用封閉液1∶8 000稀釋，100 μL/孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1 h。 洗滌：用PBST洗5次，蒸餾水洗2次。顯色：加新鮮配制的底物溶液100 μL/孔暗處放置5-30 min，顯示藍色。終止反應，比色：加50 μL/孔終止液，顏色變黃；用酶標儀測定450 nm處各孔的吸光值，陽性反應的最大稀釋度為待測樣品的效價。

1.2.6 ELISA檢測抗體相對親和力 方法同1.2.5。用抗原包被酶標板，使用兩個濃度梯度即0.5 μg/mL和1.0 μg/mL抗原包被，4℃放置過夜；以多抗濃度的對數為橫坐標，A450值為縱坐標作圖。以曲線達到水平的A450值為100%，求出A50，即50%的A450值時對應的抗體摩爾濃度。按照文獻［9，10］的方法進行計算。

1.2.7 Western blot 檢測 將收集的細胞加入SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，離心后取上清液進行SDSPAGE后電轉移至PVDF膜上，以5%的脫脂牛奶封閉2 h，與自制兔抗人、鼠抗人TRIP-1的多克隆抗體4℃過夜，之后用TBST每10 min洗1次，共3次；加入相應二抗室溫1 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，曝光。

1.2.8 細胞免疫熒光 固定在蓋玻片上的細胞用PBS漂洗3次，每次5 min；用3.7%的甲醛固定細胞，37℃ 10 min；0.1% TritonX-100透化10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；5%山羊血清（PBS配制）室溫封閉1 h；去除山羊血清封閉液之后，直接加入5%BSA稀釋的一抗，4℃雜交過夜。PBS漂洗5次，每次5 min；加入5% BSA稀釋的二抗，室溫避光雜交1 h；PBS漂洗5次，每次5 min；抗催滅封片劑封片，激光共聚焦熒光顯微鏡上觀察。

1.2.9 ProteinG親和層析柱純化抗體 配制緩沖液：起始緩沖液為TBS緩沖液洗脫緩沖液為pH2.7 0.1 mmol/L甘氨酸鹽酸；準備收集管：取1.5 mL離心管，每支離心管加70 μL pH9.0 1 mol/L Tris-HCl；樣品準備：抗血清經TBS進行透析過夜，并經0.22 μm微孔濾膜濾過。

透析過的待純化的樣品15-25 mL上柱，流速為0.5 mL/min，將留出的樣品反復過柱；然后以同樣的流速用10-20倍體積的TBS緩沖液洗滌，去除未結合和非特異性結合的蛋白，可通過測定OD280的吸光度判定洗滌是否完全；洗脫緩沖液（pH2.7，0.1 mmol/L甘氨酸鹽酸）6-7 mL每管1 mL收集洗脫液，測每管OD280吸收值。收集第2洗脫峰，BCA法測蛋白含量，4℃保存備用；純化的抗體用SDS-PAGE電泳鑒定其純度用12%分離膠、5%濃縮膠，恒流下電泳2 h，考馬斯亮藍R250（Pharmacia）染色。

2 結果

2.1 TRIP-1蛋白的表達與純化

利用構建好的pET-His-TRIP-1載體分別轉化大腸桿菌BL21（DE3），成功地原核誘導表達TRIP-1全長蛋白，并且用純化好的蛋白進行下一步試驗，即免疫小鼠和新西蘭大耳兔（圖1）。

圖1 TRIP-1蛋白的誘導表達及純化結果

2.2 TRIP-1抗血清效價檢測

將用TRIP-1蛋白抗原免疫4次之后的新西蘭大耳兔以及小鼠抽取血清樣本通過ELISA法測量抗體效價，計算陽性血清和陰性血清A450值之比（antiserum/preimmune serum，a/p），當a/p≥2.1時為陽性，當a/p<2.1而a/p≥1.5時為可疑，當a/p<1.5時為陰性。如圖2所示，兩種抗血清稀釋倍數為106時，和陰性血清相比，仍呈現陽性反應，表明免疫后的兩種抗血清的效價均達到106。

2.3 抗體親和力檢測

通過對純化的兔抗人TRIP-1多克隆抗體進行相對親和力檢測測定，并且計算抗體親和常數大約是105-106，可以進行相關免疫學試驗（圖3）。

2.4 利用抗體檢測真核細胞及組織蛋白表達情況

圖2 經免疫過的兔（A）和小鼠（B）的血清通過ELISA法測定效價

圖3 TRIP-1兔抗相對親和常數計算圖表

利用抗體檢測真核細胞及組織蛋白表達情況，各細胞及組織蛋白，12%蛋白膠PAGE電泳，將制作好的TRIP-1鼠源及兔源抗體用于Western blot試驗，檢測多種細胞和組織當中的TRIP-1表達情況。將所制備抗體5 000倍稀釋用來檢測真核細胞內源性TRIP-1蛋白表達情況，如圖4所示，兔抗和鼠抗均能夠很好地檢測真核細胞內源性的蛋白表達，并且也能夠直接檢測從動物不同組織中抽提出來的蛋白。說明制備的抗體具有較高的靈敏度和特異性。

圖4 Western blot檢測TRIP-1鼠源（A）及兔源（B）抗體

2.5 細胞免疫熒光法檢測TRIP-1蛋白細胞內定位

TRIP-1蛋白細胞免疫熒光檢測，取HeLa細胞進行免疫熒光，用Phallodin-FITC染微絲（actin），同時用TRIP-1兔抗來檢測其在細胞內的定位情況，二抗用rhodamine標記的羊抗兔抗體。熒光顯微鏡下拍照（圖5）。將制備的TRIP-1兔抗人多克隆抗體200倍稀釋進行細胞免疫熒光化學染色試驗分析，發現制備的抗體能夠進行細胞免疫熒光化學染色，且染色效果十分良好，同時發現，TRIP-1蛋白在細胞質內質網位置定位明顯。

圖5 TRIP-1蛋白細胞免疫熒光檢測

2.6 TRIP-1抗體純化

取免疫過的兔和鼠的抗血清，利用proteinG方法進行純化，成功將2種抗體進行了初步純化，從純化結果（圖6）中可以清楚地看到抗體重鏈（55 kD）和輕鏈（26 kD）。

3 討論

圖6 抗體純化結果圖

生命科學的研究，尤其是針對某個蛋白的功能研究，抗體是至關重要的工具。抗體可分為多克隆抗體，單克隆抗體等。單克隆抗體的特異性較好，但制作過程比較繁瑣，多克隆抗體則制作較為容易。本研究通過原核誘導表達發現誘導的TRIP-1蛋白主要表達在包涵體當中，有文獻報道用含尿素的緩沖液洗滌包涵體，可初步純化目的蛋白，可以滿足后續試驗中對抗原的要求［11］。鑒于此，本試驗選擇用尿素法提取并洗滌純化包涵體得到較為純凈的TRIP-1蛋白。采用直接免疫新西蘭白兔和昆明鼠的方法獲得抗血清。ELISA是檢測抗體質量相關系數的重要手段［12，13］。本試驗ELISA檢測結果顯示抗血清效價極高，并且計算出的親和常數證明抗體可用于免疫學試驗。未經純化的抗血清，稀釋很高的倍數仍可用于Western blot和免疫熒光等試驗，且有非常好的特異性。細胞免疫熒光法檢測TRIP-1蛋白細胞內定位發現，TRIP-1蛋白在細胞質內質網位置定位明顯，此結果與發表的相關文獻吻合［6］。同時，本研究通過proteinG的方法對多克隆抗體初步進行了純化。以上結果表明，成功制備、純化了特異性的TRIP-1多克隆抗體，為今后深入研究TRIP-1的生物學活性和與疾病的關系及可能的臨床應用奠定了基礎。

4 結論

本研究通過原核誘導表達和包涵體純化，獲得了較為純凈的TRIP-1全長蛋白。通過免疫新西蘭大耳兔和昆明小鼠，獲得了抗血清。通過ELISA、Western blot和免疫熒光試驗驗證了抗體的效價和特異性。結果證明用這種方法可以制備具有較高特異性和靈敏度的多克隆抗體。

［1］ Chen RH, Miettinen PJ, Maruoka EM, et al. A WD-domain protein that is associated with and phosphorylated by the type ［J］. Nature,1995, 377（6549）：548-552.

［2］ Choy L, Derynck R. The type II transforming growth factor（TGF）-β receptor-interacting protein TRIP-1 acts as a modulator of the TGF-β response ［J］. J Biol Chem, 1998, 273（47）：31455-31462.

［3］ Perez RE, Navarro A, Rezaiekhaligh MH, et al. TRIP-1 regulates TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition of human lung epithelial cell line A549 ［J］. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol,2011, 300（5）：L799-L807.

［4］ Metz-Estrella D, Jonason JH, Sheu TJ, et al. TRIP-1：A regulator of osteoblast function ［J］. Journal of Bone and Mineral Research,2012, 27（7）：1576-1584.

［5］ Ramachandran A, Ravindran S, George A. Localization of transforming growth factor beta receptor II interacting protein-1 in bone and teeth［J］. J Histochem Cytochem, 2012, 60（4）：323-337.

［6］ Ahlemann M, Zeidler R, Lang S, et al. Carcinoma-associated eIF3i overexpression facilitates mTOR-dependent growth transformation［J］. Molecular Carcinogenesis, 2006, 45（12）：957-967.

［7］ Asano K, Kinzy TG, Merrick WC, et al. Conservation and diversity of eukaryotic translation initiation factor eIF3 ［J］. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272（2）：1101-1109.

［8］ 羅惠霞, 李敏, 王玉炯.包涵體蛋白復性的幾種方法［J］.生物技術通報, 2007（5）：96-98.

［9］ Beatty JD, Beatty BG, Vlahos WG. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay ［J］.Journal of Immunological Methods, 1987, 100（1-2）：173-179.

［10］ Ding G, Zhu J, Wang Z, et al. Measurement of scFv antibody affinity using non-competitive enzyme-linked immunosorbent assay ［J］.南京醫科大學學報（英文版）, 2005, 19（2）：4.

［11］ 秦睿玲, 張西臣, 李建華, 等.柔嫩艾美球蟲間接ELISA檢測方法的建立［J］.中國獸醫科技, 2004, 34（7）：60-63.

［12］ 張小兵, 邸祿芹, 吳萌, 等.單克隆抗體與多克隆抗體配對ELISA 方法比較［J］.生物技術通報, 2009（11）：125-129.

［13］ 陳卓, 劉家駒, 畢亮, 等. NPR1多肽抗體的制備和應用［J］.生物技術通報, 2012（1）：145-150.