一株拮抗放線菌T151的鑒定及其抑菌活性物質分析

李曉鳳 李淑英 聶瑩 杜歡 楊帆 童大磊 韋日清 趙仲麟 唐選明

（1. 中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193； 2. 內蒙古農業大學，呼和浩特 010018； 3. 河南農業大學理學院，鄭州 450002）

從微生物代謝產物中尋找控制有害生物的生物農藥是新農藥研究的一個重要方向[1]。隨著環境保護、綠色食品及農業可持續發展的需要，農用抗生素作為低毒低殘留的生物農藥日益受到人們的重視[2]。目前，從微生物中發現的大約8 000種生物活性物質中近70%是由放線菌產生的[3]。

T151是從土壤中分離純化得到的一株具有抑菌活性的放線菌，為了研究該菌株是否具有潛在生防利用價值和田間應用前景，我們對發酵液中活性代謝產物的抑菌作用范圍及其在不同條件下抑菌活性的穩定性作了初步分析，旨在為T151的進一步研究和應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 放線菌T151本實驗室從海南海口市郊的土壤中分離得到；指示菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）和根霉（Rhizopus）均由本實驗室保存。

1.1.2 儀器 恒溫培養振蕩器（ZHWY-200H，上海智城分析儀器制造有限公司）、電熱恒溫培養箱（DHP-9082型，上海一恒科學儀器有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-50A，上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、三目生物顯微鏡（XSP-BM10A，上海光學儀器六廠）、大型離心機（CR22GⅡ，日本日立）、透射電子顯微鏡（H-T500，日本日立）。

1.1.3 培養基 根霉培養基：PDA培養基。枯草芽孢桿菌和大腸桿菌培養基：LB培養基。T151發酵培養基：淀粉2%、黃豆餅粉0.2%、大米粉0.2%、葡萄糖0.5%、酵母粉0.2%、KNO30.2%、NaCl 0.1%、K2HPO40.1%、MgSO40.05%、CaCO30.3%。 所 有 培養基均在120℃下滅菌40 min備用。

1.2 方法

1.2.1 菌種鑒定 形態學鑒定：采用埋片法[4]在發酵培養基上培養菌株T151，用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察拍照。分子生物學鑒定：提取T151的基因組，放線菌16S rDNA擴增引物及方法參照文獻[5]，擴增片段送Invitrogen公司測序。測序結果在NCBI網站利用Blast進行比對，調出相似序列，用Clustal X1.83和MEGA 3.1 軟件構建系統發育樹[6]。

1.2.2 抑菌活性分析 采用管碟法[3，7-9]，分別以大腸桿菌，枯草芽孢桿菌和根霉為指示菌，測定T151發酵液的抑菌活性。試驗重復3次，以十字交叉法測量抑菌圈直徑大小。

1.2.3 發酵液活性物質穩定性分析 以枯草芽孢桿菌為指示菌，采用管碟法測定發酵液在不同條件下處理后的抑菌活性，根據抑菌圈直徑的改變確定其穩定性[3，9-11]。

熱穩定性分析：各取發酵液2 mL，分別置于80℃、90℃、100℃和110℃條件下加熱20 min和30 min，測抑菌活性，試驗重復3次。

酸堿穩定性分析：各取5 mL發酵液，分別用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH調節pH，分別調到pH為3、5、7、9、11和12，并放置于冰箱4℃，12 h，然后將各pH調回7左右，測抑菌活性，試驗設3個重復。

2 結果

2.1 T151菌種鑒定結果

2.1.1 形態特征 T151菌落緊密、多皺，菌絲體呈淡紫灰色。如圖1所示，光學顯微鏡下菌絲體呈直立或柔曲。如圖2所示，掃描電鏡下其孢子絲呈鏈狀直絲，孢子表面光滑無突起，孢子呈圓柱狀兩端方正平滑，參照《鏈霉菌鑒定手冊》，該菌株總體表現為鏈霉菌屬特點。

圖1 T151光學顯微鏡形態觀察

圖2 T151電子顯微鏡形態觀察

2.1.2 16S rDNA序列分析及系統發育構建 PCR擴增所得T151菌株16S rDNA全長1 486 bp，將T151的16S rDNA測序結果經Blast 比對，與T151菌株16S rDNA同源性較高的菌株均為鏈霉菌屬放線菌，從中選擇15條同源性高于99%的16S rDNA序列構建系統發育樹，如圖3所示，T151菌株與Streptomycessp. SHXFF-2 partial 在同一分枝上，結合菌株形態特征，初步鑒定T151為鏈霉菌新種。

2.2 T151發酵液抑菌活性分析

從表1可以看出，T151的發酵產物對3種指示菌均有明顯的抑菌活性。對G-細菌大腸桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈面積為593.66 mm2；其次為G+細菌枯草芽孢桿菌，抑菌圈面積達到490.63 mm2；對真菌根霉也有明顯的抑制作用，抑菌圈面積為200.96 mm2。

2.3 T151發酵液的穩定性分析

圖3 T151的系統發育樹

表1 T151發酵液對3種指示菌的抑制效果

2.3.1 熱穩定性 如圖4所示，隨著對T151發酵液處理溫度的升高，處理時間的延長，抑菌圈直徑減小。菌株T151發酵液分別在80℃、90℃和100℃處理20和30 min，抑菌活性變化不是很大；而發酵液在110℃條件下處理20 min后，抑菌活性大幅度降低，處理30 min后活性消失。以上結果表明，T151發酵液在80-100℃內相對穩定性，而當溫度升高到110℃時，穩定性急劇下降。

圖4 T151發酵液的熱穩定性

2.3.2 酸堿穩定性 如圖5所示，T151發酵液在pH5-11條件下抑菌活性比較穩定，抑菌圈直徑幾乎沒有變化，而pH 在3和12時，抑菌效果明顯降低，特別是在堿性環境下。說明T151發酵液中活性成分對強酸強堿的穩定性較差。

圖5 T151發酵液的酸堿穩定性

3 討論

隨著對土壤放線菌代謝特性的深入研究，以及分離和培養方法的進一步改進，越來越多的土壤放線菌將得到分離，土壤放線菌豐富的多樣性將不斷地被揭示。鏈霉菌一直被認為是產生各種抗生素的主要來源。遺傳多樣性分析表明，鏈霉菌屬可產生的抗生素約有上萬種，而目前發現的只是很小一部分。隨著微生物對已有抗生素抗藥性的增加，人類對新的藥物資源的需求越來越迫切。但隨著已經發現的微生物源化合物數量的增加，從普通環境中分離篩選新的活性物質產生菌的難度日益上升。可見，從土壤環境中篩選稀有菌種已經成為當前微生物資源開發利用的重要研究課題。

本研究所用放線菌T151是從海南海口市郊的土壤中分離得到，綜合形態學特征和分子生物學鑒定，該菌株屬于鏈霉菌屬。抑菌試驗結果表明，該菌株發酵液具有廣譜的抗菌活性，對G+細菌、G-細菌和真菌均有較強的抑制作用，并且對細菌的抑菌作用強于對真菌的抑菌作用。穩定性分析表明，發酵液中具有抗菌作用的活性成分對熱、酸堿具有極強的穩定性，這些研究對于活性物質的進一步分離、純化、結構解析和功能研究等提供了理論依據。

后續研究中，還有待對該菌種進行系統的鑒定；還需要分離純化活性成分，對活性成分進行鑒定和系統的抗菌譜研究等。

4 結論

T151的形態學觀察表明，該菌株具有典型的鏈霉菌屬特征；16S rDNA鑒定結果證實，該菌株與Streptomycessp. SHXFF-2 partial處于同一分枝上，是鏈霉菌屬新種；發酵液的抗菌活性研究表明，T151的發酵液具有較強的抗菌活性，該菌株對G+細菌枯草芽孢桿菌、G-細菌大腸桿菌和真菌根霉均有較強的抑制作用；穩定性分析表明，T151發酵液具有較強的熱、酸堿穩定性，具有較強的可操作性。

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