甲苯、乙苯和二甲苯對中華新米蝦的毒性效應

李學峰,周啟星,羅 義

(南開大學環境科學與工程學院,環境污染過程與基準教育部重點實驗室,天津 300071)

苯系物(BTEX)是苯(benzene)、甲苯(toluene)、乙苯(ethylbenzen)和二甲苯的 3種同分異構體(o-,m-,p-xylene)的統稱.BTEX 是揮發性單芳香烴,是石油及其副產品汽油、柴油燃料的主要組成成分,并作為殺蟲、塑料和合成纖維的原材料廣泛使用[1-2]. BTEX具有較高的水溶性和毒性,容易被水生生物吸收,易于從溢出或泄漏的儲油罐進入地下水和飲用水,對生態系統、水生生物和人類健康造成威脅[3].近年來,關于苯的水生態毒性有較多報道,而甲苯、乙苯、二甲苯的水生態毒性相對較少. Holcombe等[4]研究了二甲苯對鰷魚、虹鱒魚、藍腮魚、金魚、水蚤和蝸牛的急性毒性;Niederlehner等[5]研究了甲苯、乙苯和二甲苯對角突網紋蚤的急性和慢性毒性;Masten等[6]研究了乙苯對于三種水生生物大西洋銀河魚、塘蝦、硅藻和水藻的急性毒性.然而國內僅有范亞維等[7-8]研究了這3種污染物對斑馬魚、大型溞和霍普水絲蚓的急性毒性,缺少對不同種類水生生物的毒理研究,及對底棲生物毒性的探討.在實際水生生態系統中,通常存在多種污染物,它們彼此影響,產生拮抗,相加或協同作用,聯合毒性的研究對于客觀評價污染物的危害性以及環境標準制定更具實際意義,而甲苯、乙苯和二甲苯的聯合毒性效應國內尚未見報道.

中華新米蝦(Neocaridina denticulata sinensis)屬甲殼綱、十足目、匙指蝦科、米蝦屬,是一種小型經濟蝦,可食用或作餌料,廣泛分布于我國稻田、池塘、溪流及湖泊等淡水水域;同時,具有生活力強、繁殖快等特點.

因此,本研究以中華新米蝦為受試生物,以甲苯、乙苯和二甲苯(TEX)為目標化合物,基于等毒性溶液法、毒性單位法和混合毒性指數法研究了TEX污染物對水生動物的聯合毒性效應,為今后3種化合物的水質基準或標準的制定、污染控制和安全風險評價提供基礎數據和科學依據.

1 材料與方法

1.1 受試污染物及其溶液的配制

試驗藥劑:甲苯、乙苯、二甲苯和二甲基亞砜購于天津市津東天正精細化學試劑廠,吐溫80購于Sigma(美國),均為分析純.

母液配制:試驗使用助溶劑二甲基二砜和乳化劑吐溫 80配制母液.母液每次試驗前配得,不保存,其中助溶劑和乳化劑不超過100μL/L[9].

1.2 受試生物

試驗生物中華新米蝦購于無錫市南禪寺花鳥魚蟲市場,體長 1.2～1.5cm,體重 0.06～0.08g/只,置于魚缸中,以普通粉末狀魚食喂食,溫度保持在(23±1)℃左右,每 d喂食并換水 1次,所換水為曝氣24h以上自來水,試驗前24h停止喂食,馴化兩周,馴化期間中華新米蝦沒有出現死亡.實驗選用中華新米蝦行動活潑,反應靈敏,外觀正常,個體均勻.

1.3 實驗儀器與條件

主要儀器:曝氣裝置,溫度計,恒溫儀,電子分析天平,人工氣候培養箱(SPX-300I-C);pH計(Sartorius ,PB-10);溶解氧測定儀(HACH,HQ-10).

試驗條件:實驗在 1L的大燒杯中進行,試驗溶液體積為1L,每個燒杯放入10只中華新米蝦.實驗周期為 96h,期間不喂食.試驗方式為半靜態,12h換1次水;試驗用水為曝氣48h以上的自來水,溶解氧(DO) 6.4mg/L(飽和度≥60%);pH 值為 7.0左右;溫度為(23±1)℃;光照周期為 16:8(day: night).

1.4 聯合毒性實驗設計

在進行中華新米蝦聯合毒性之前,分別測試其單一毒性.首先進行預實驗,分別得到 TEX 對中華新米蝦全部存活和全部死亡的濃度范圍,設定6個濃度,每個濃度做3個平行,同時做空白對照和最高溶劑對照.根據預實驗結果,甲苯的正式試驗濃度分別 6.8,9.1,12.3,16.6,22.4,30mg/L;乙苯和二甲苯的正式試驗濃度均為 6.3,7.9,10.0,12.6,15.8,20mg/L.

在上述單一毒性試驗的基礎上,運用等毒性溶液法(ETS)對 TEX所組成的二元混合物的聯合毒性進行評價.為了便于計算和試驗結果的比較,張毓琪等[10]提出,在進行混合物的生物監測時,一般可采用毒性單位(Toxic Unit, TU)這一概念.

將單一苯系物對中華新米蝦 96h-LC50值記為 1個毒性強度單位.每個二元混合物(甲苯-乙苯、乙苯-二甲苯和甲苯-二甲苯)按照毒性單位比例的不同,分為4個試驗組(4:1;3:2;2:3;1:4).

運用毒性單位法(TU)和混合毒性指數法(MTI)對 TEX所組成的三元混合物的聯合毒性進行評價.根據修瑞琴等[11]提出按單一毒性最終LC50值進行毒性單位1:1:1或濃度1:1:1的聯合毒性實驗是較為簡便的.所以,本實驗按照毒性單位1:1:1和濃度1:1:1分為2個試驗組.利用常用等對數梯度1,1.8,3.2,5.6和10設置實驗梯度,即按照毒性單位1:1:1設置5個濃度組的總毒性單位(Total TU)分別為1,1.8,3.2,5.6和10;按照濃度1:1:1設置 5個濃度組的總濃度為 10,18,32,56,100mg/L.每個實驗組,3個平行,同時設計空白對照組和最高溶劑對照(100μL/L).記錄 48h和96h各濃度組中華新米蝦的死亡數,并及時撈出死蝦.

1.5 聯合毒性分析方法

圖1 等毒性溶液法示意Fig.1 Curve for the explanation of equal toxicity solution method when examining the joint toxic action between two chemicals

等毒性溶液法(ETS)是一類經典的經驗主義方法,具有簡單、快速、可視化的優點,常常用來研究二元混合物的聯合毒性作用[12].試驗結束后,計算按不同毒性單位混合的各試驗組的平均死亡率及標準差,并將所得數據以不同混合比為橫坐標,致死率為縱坐標作折線圖.如圖1所示,如果所做的毒性效應曲線在兩種物質半數致死率連線的上方,則為協同作用;若毒性效應曲線在聯線的下方,則為拮抗作用;在連線上下波動的是相加作用.

由 Sprague等[13]首先提出,Marking等[14]將這一概念推廣到評價混合物的聯合毒性.通過分別計算相加指數M和M0去確定特定二元混合物的聯合作用類型[15-16].根據毒性單位法對試驗結果進行評價,公式如下:

式中:TUi為混合物中i的毒性單位;max(TUi)為混合物中各組分毒性單位最大值;M為混合物中各組分的毒性單位之和.當M=1時,聯合效應為簡單相加作用;當1 M0為拮抗作用.

混合毒性指數法(MTI)是由 K?nemann[17]首次提出,評價多元混合物對魚的聯合毒作用的方法.MTI的定義為:

評價標準為:當 MTI=1時,為簡單相加作用;當MTI<0時,為拮抗作用;當MTI>1時,為協同作用;當 MTI=0 時,為獨立作用;當 0

1.6 統計學分析

利用SPSS13.0統計軟件實驗所得數據進行分析,所有試驗數據均以 3個平行組數據的平均值±標準差(Means±SD)來表示.采用單位概率法(Probit Analysis)進行回歸分析求得半致死濃度LC50值,采用單樣本K-S Test檢驗數據的正態分布性質,采用單樣本T檢驗(One-SimpleTTest)對對照組與實驗組進行差異顯著性分析,P**<0.05表明差異顯著,P*<0.01表明差異極顯著.

2 結果與分析

2.1 TEX對中華新米蝦的單一毒性

圖2 TEX對中華新米蝦的48h和96h單一毒性效應Fig.2 The curves for single toxic effects of TEX on Neocaridina denticulata sinensis after a 48h or 96h exposure

在試驗期間,空白和溶劑對照組均未出現中華新米蝦的死亡或異常現象.當甲苯,乙苯,二甲苯濃度超過5mg/L時,中華新米蝦開始呈現明顯的中毒癥狀,身體失去平衡,快速無序游動,非常不安,隨后在水面出現側翻,腮部出現明顯充血癥狀.當甲苯濃度達 30mg/L,暴露時間達 30h,乙苯和二甲苯濃度達20mg/L,暴露時間20h時,中華新米蝦全部死亡.由圖2所示,隨著BTEX濃度的增加及暴露時間的延長,中華新米蝦的死亡率逐漸升高.

表1 TEX對中華新米蝦單一毒性數據統計學分析Table 1 Statistical analysis of single toxicity data of TEX on Neocaridina denticulata sinensis

表2 中華新米蝦的LC50對TEX的回歸關系Table 2 Regression relationships between the mortality of Neocaridina denticulata sinensis and the concentration of TEX

2.2 TEX二元混合物對中華新米蝦的聯合毒性

由圖 3可見,甲苯和乙苯按不同毒性單位比(均為1個毒性單位)混合96h對中華新米蝦的致死率為 43.3%～56.7%,與甲苯或乙苯單獨作用時毒性效果相近,且所做的毒性效應曲線在 1個毒性單位甲苯溶液與 1個毒性單位乙苯溶液致死率連線上下波動.因此,甲苯與乙苯所組成的二元混合物的聯合作用表現為相加作用.

圖3 甲苯-乙苯二元混合物對中華新米蝦聯合毒性Fig.3 The curve for joint toxicity of binary mixtures of toluene and ethylbenzene on Neocaridina denticulata sinensis

由圖4可見,乙苯和二甲苯同樣按不同毒性單位比(均為1個毒性單位)混合96h對中華新米蝦的致死率為 46.7%～56.7%,與乙苯或二甲苯單獨作用時毒性效果相近,且所做的毒性效應曲線在1個毒性單位乙苯溶液與1個毒性單位二甲苯溶液致死率連線上下波動.因此,乙苯與二甲苯所組成的二元混合物的聯合作用同樣表現為相加作用.

由圖 5可見,甲苯、二甲苯按不同毒性單位比(均為1個毒性單位)混合96h對中華新米蝦的致死率為36.7%～60%,與甲苯或乙苯單獨作用時毒性效果相近,且所做的毒性效應曲線在 1個毒性單位甲苯溶液與 1個毒性單位乙苯溶液致死率連線上下波動.因此,甲苯、乙苯所組成的二元混合物的聯合作用表現為相加作用.

圖4 乙苯-二甲苯二元混合物對中華新米蝦聯合毒性Fig.4 The curve for joint toxicity of binary mixtures of ethylbenzene and xylene on Neocaridina denticulata sinensis

圖5 甲苯-二甲苯二元混合物對中華新米蝦聯合毒性Fig.5 The curve for joint toxicity of binary mixtures of toluene and xylene on Neocaridina denticulata sinensis

在采用等毒性溶液法(ETS)評價甲苯,乙苯,二甲苯兩兩混合所組成的二元混合物96h聯合毒性時,所做的毒性效應曲線均在兩種物質半數致死率連線上下波動,均表現為相加作用.這表明它們對水生生物的作用機理相近,總的毒性效應為各因素單獨作用之和,并無顯著的拮抗或協同作用.

2.3 TEX三元混合物對中華新米蝦的聯合毒性

甲苯-乙苯-二甲苯按照毒性單位1:1:1混合,采用毒性單位法(TU)評價聯合作用效果,當暴露時間為 48h時,M0=2.998>M=1.574>1,故聯合作用表現為部分相加作用(表 3);當暴露時間為96h,M=0.987 <1,聯合作用表現為協同作用.采用混合毒性指數法(MTI)評價聯合作用效果,當暴露時間為48h,0 < MTI = 0.587< 1,聯合作用表現為部分相加作用;當暴露時間為 96h,MTI =1.013>1,聯合作用表現為協同作用.甲苯-乙苯-二甲苯按照濃度1:1:1混合,采用毒性單位法(TU)評價聯合作用效果,暴露時間為48h,M0=2.672 >M=1.697>1,聯合作用表現為部分相加作用;當暴露時間為96h時,M=0.926 <1,聯合作用表現為協同作用.采用混合毒性指數法(MTI)評價聯合作用效果,當暴露時間為 48h,01,聯合作用表現為協同作用.

由表 3可知,不論采用的方法是毒性單位法還是混合毒性指數法,當暴露時間為48h時,聯合作用方式均表現為部分相加作用,而當暴露時間為96h時,聯合作用均表現為協同作用.也就是說,隨著暴露時間的增加,三者聯合毒性作用從部分相加作用轉變為毒性增加的協同作用.

3 討論

3.1 單一毒性

3種苯系污染物對中華新米蝦的單一急性毒性作用大小順序為:乙苯>二甲苯>甲苯,這與范亞維等[7-8]在研究 TEX對水生生物的急性毒性效應時所得到的作用結果非常類似.TEX污染物在毒性作用上的差異很可能與其在分子結構的差異密切相關.TEX都屬于單芳香烴,但苯環上的取代基的數量及位置不同,這種分子結構上的差異必然導致一些物理化學性質的不同,從而導致其水生生態毒性的差異.TEX均屬于非極性麻醉型化合物,而非極性麻醉型化學物質所引起的生物麻醉的能力與其疏水性成正比,主要表現為對生物體細胞膜的穿透性破壞作用[18].因此,非極性麻醉型化學物質的生態毒性可以用辛醇-水分配系數(lgKow)來確定[19].甲苯、乙苯和鄰、間、對位二甲苯20℃辛醇-水分配系數lgKow分別是2.69、3.15、2.77、3.20和3.15,即3種物質疏水性順序為:乙苯>二甲苯(總)>甲苯,驗證了本文的實驗結果.

3.2 聯合毒性

聯合毒性作用已經得到越來越多的關注,相關理論也日益成熟.如今,當預測化學物質的聯合作用時,通常認為作用方式(Mode of Action)服從兩種基本模型,分別為 a)濃度相加(concentration addition, CA),指化學物質遵循以相同方式作用于受體. Poch[20]以嚴格的作用機制角度,認為這個模型僅僅適用于那些擁有相同分子結合部位的化合物.Berenbaum[21]以廣義現象學的角度,認為不同化學物質只要對生物的毒性響應值相似,即可認為符合濃度相加模型.但是,實際上,濃度相加模型已經被視為是一種通用模型去預測混合物的聯合作用,尤其在缺乏研究物質作用機制參考資料的條件下.b)獨立作用(independent action, IA),指化學物質不以相同方式作用于受體. 雖然獨立作用被認為在毒理學理論研究中意義重大,但是很多科學家懷疑它的實際應用,特別是在整個生物體和種群水平,還有水污染控制研究方面.目前,這兩種參考模型已經廣泛應用于生態毒理評價中,并收到了良好的效果[22-24].

表3 甲苯-乙苯-二甲苯三元混合物按毒性單位1:1:1和濃度1:1:1混合對中華新米蝦的聯合毒性Table 3 Joint toxicity of ternary mixtures of toluene, ethylbenzene and xylene on Neocaridina denticulata sinensis after a 48h or 96h exposure in toxic unit ratio 1:1:1 and concentration ratio 1:1:1

TEX具有極其相似的化學結構與物理化學性質,基于文獻和上述毒性試驗所得到的毒理數據,可以看出 3種物質對于不同水生生物的毒性強度也非常相似,均在一個數量級上.所以,理論上很容易理解 TEX應當具有相同的作用方式,進一步假設認為,TEX應當遵循濃度相加模型.因此,本文假設TEX的聯合作用方式符合濃度相加模型.

本論文基于等毒性溶液法研究了TEX二元混合物對中華新米蝦的聯合毒性,其聯合作用結果表現為相加作用.在采用毒性單位法和混合毒性指數法評價TEX三者混合所組成的三元混合物48h和96h的聯合毒性時,聯合毒性效應均表現為:隨著暴露時間的推移,由部分相加轉化為協同作用.這說明聯合作用的類型,會隨著暴露時間的延長隨之發生變化[25-28].然而,即使96h聯合作用均表現為協同作用,但是協同作用的傾向不顯著,如M=0.987,0.926,MTI=1.013,1.077均非常接近于 1,這表明聯合作用接近于相加作用.由于實驗誤差的存在,M=1是個理想狀態,實驗室很難得到.所以,Broderius等[29]認為只要實驗組的總TU=1±0.2,就可將其作用結果視為相加作用.由表 4.2 可知,M值為 0.925～1.231,接近于 1 且在1±0.2范圍內,因此可理解為相加作用.因此, TEX三元混合物的聯合作用主要表現為相加作用.綜上,TEX污染物對中華新米蝦的聯合作用類型符合相加作用.

TEX是三種簡單的單芳香烴,結構非常相似.因此,它們具有相似的物理化學性質,例如分子量、密度、沸點和辛醇水分配系數等.另外,它們都是麻醉性化學物質,它們毒性作用方式同樣是麻醉性的,并且 TEX化合物都作用于生物細胞膜[30-31].而且通過上述水生動物的毒理實驗結果證實了TEX表現出了相似的毒性作用.所以,CA模型非常合理地預測了TEX混合物的單一毒性,而且完美的預測了TEX混合物的聯合毒性效應.

目前,對苯系物的中毒機制研究的還比較少,苯系物對水生生物的毒性數據也比較缺乏,而且,苯系物的聯合作用也是非常復雜的,受到多種因素的影響,不同評價和模型方法會得出不同的結論,所以對于苯系物對水生生物的聯合作用還有待進一步的討論和深入的研究.但是,本論文提供了豐富的甲苯、乙苯和二甲苯對水生生物的單一急性和聯合毒性的毒理數據,對于今后修訂苯系物水質標準和制定苯系物的水質基準有著深遠的意義,而且在把甲苯、乙苯和二甲苯整體作為一個水質指標時,可以利用相加作用模型進行分析與評價.

4 結論

4.1 甲苯、乙苯和二甲苯對中華新米蝦的單一急性毒性試驗中,96h-LC50分別為 13.8,10.4,11.3mg/L,均屬于中等毒性毒物,且毒性大小順序為:乙苯>二甲苯>甲苯.

4.2 基于等毒性溶液法,甲苯、乙苯和二甲苯的二元混合物的聯合毒性作用結果為相加作用.

4.3 基于毒性單位法和混合毒性指數法,甲苯、乙苯和二甲苯的三元混合物的聯合毒性作用結果表現48h部分相加作用,96h協同作用,但作用并不明顯,可以近似認為是相加作用.

4.4 驗證了甲苯、乙苯和二甲苯的聯合作用符合濃度相加(CA)模型,并進一步驗證了具有相同作用方式(MoA)的化學物質的聯合作用很可能同樣符合濃度相加(CA)模型.

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