環境相關濃度下的藥物對大型蚤的多代慢性毒性

楊曉凡,陸光華,劉建超,閆振華

(1.河海大學環境學院,江蘇 南京 210098；2.安徽工程大學生物與化學工程學院,安徽 蕪湖 241000)

由于人類的活動,大量的藥物污染物進入水環境系統[1],雖不像常規有機污染物般難降解,易產生脅迫效應[2],但是持續不斷地向水環境釋放會造成“假持久性”,并對水生生物及水生生態構成潛在的威脅[3-4].藥物數量巨大,種類繁多,包括抗生素、非甾體類抗炎藥、鎮痛劑、降血脂類和β-受體阻滯劑等等[5].作為PPCPs(藥物和個人護理品)主要組成部分,藥物被列為新興污染物[4,6].國內外抗生素和非甾體抗炎藥的檢出頻繁,之前對中國環太湖流域的藥物應用調查表明磺胺甲惡唑(磺胺類抗生素)、氧氟沙星(喹諾酮)和布洛芬(非甾體類抗炎藥)使用量大,應用頻繁,檢出頻率和檢出量(表1)尤其突出,因此在本研究中被列為“優先污染藥物”進行研究.

表1 磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬理化性質及水體殘留Table 1 Physico-chemical properties of sulfamethoxazole, ibuprofen and ofloxacin and their residue in water

大型蚤(D. magna)具有繁殖快、敏感性高的特點,往往在低于致死濃度幾個數量級的條件下,仍能觀察到有毒化合物的慢性毒性效應[12].已有藥物對大型蚤毒性的研究上,偏重急性毒性研究[13-14].磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬對大型蚤慢性毒性研究較少,而且慢性毒性研究主要集中于兩代以內的研究[12,15].Ahlers等[16]認為只有通過長期的生活史暴露研究才能確切認知化合物的慢性毒性.

研究表明,黑頭軟口鰷(Pimephales promelas)暴露于1.0ng/L乙炔基雌二醇會產生一定的毒性效應[17],但是在英國的地表水中檢測到最高乙炔基雌二醇濃度為 3.4ng/L[18].以現實水環境中檢出的藥物濃度作為環境相關濃度研究的起點,對篩選出的“優先藥物污染物”進行相關慢性毒性研究,更具有現實意義和代表性.因此本研究以大型蚤為模式生物,研究在環境相關濃度下,磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬單一暴露和復合暴露對連續 6代的大型蚤生殖和生長的影響,分析濃度效應和各代差異,為藥物污染物對大型蚤的生態風險效應評估提供依據.

1 材料與方法

1.1 化學試劑

磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬純度＞98%(和光化學工業有限公司,日本).根據自然水體各藥物實際最大檢測濃度作為參考(表1),設定環境相關濃度的起點.磺胺甲惡唑濃度依次為0.8,8.0,80.0μg/L,氧氟沙星濃度依次為 2.0,20.0,200.0μg/L,布洛芬濃度依次為 9.0,90.0,900.0μg/L.復合暴露處理分別為M1 (M1=0.8μg/L磺胺甲惡唑+2.0μg/L 氧氟沙星+9.0μg/L 布洛芬) 、M2(8.0μg/L 磺 胺 甲 惡 唑+20.0μg/L 氧 氟 沙 星+90.0μg/L布洛芬)和 M3 (80.0μg/L磺胺甲惡唑+200.0μg/L氧氟沙星+900.0μg/L 布洛芬).用超純水溶解制備藥物儲備液.

1.2 化學分析

在暴露期間,采用液質聯用儀(Agilent 1260 UHPLC6460 QQQ三重四極質譜儀)檢測藥物的實際暴露濃度,3次重復.高濃度測試液過0.45μm玻璃纖維膜后直接分析,低濃度應用HLB萃取小柱(500 mg,6mL,Waters)富集、凈化后分析.HLB萃取小柱經過6mL甲醇(2′3mL)和6mL超純水(2′3mL)平衡,取 500mL含藥測試液,用1.0M HCl酸化至pH=3,以15mL/min的速度過柱.完成后繼續抽氣保持真空 5min,排除多余的水份.采用6mL(3′2mL)甲醇以0.5mL/min速度洗脫目標藥物.收集的洗脫液用N2(99.999%)吹脫,酸化乙腈/水(10/90, 0.01%甲酸)定容至1.0mL,冷藏待測.液質分析使用 C18(2.1mm ′50mm, 1.7μm)色譜柱,ESI源.采用多參數水質測量儀測定溶解氧(DO)和pH值.

1.3 測試生物

大型蚤(Daphnia magna)由中國疾病控制和預防中心提供,喂食斜生柵藻(Scenedesmus obliquus).斜生柵藻由中科院武漢水生生物研究所提供.M4培養液[19]培養斜生柵藻和大型蚤.大型蚤和斜生柵藻置于光照培養箱中培養,溫度(20±1)℃,光照與黑暗比 16h： 8h.培養液每周更換2 次,保持投藻密度為(2～3)′105cells/mL.

1.4 多代實驗

為了減少對蚤的損傷,實驗中用玻璃滴管轉移測試蚤.選擇近百個健康的同齡母蚤培養,產生的同期大量的第三窩幼蚤(出生時間6～24h內)作為母蚤(F0)開始多代試驗.隨機挑選出1個新生的幼蚤,即F0代,放在內盛50mL測試液的小燒杯中,每個處理20個平行.不加藥的測試液作空白對照.小燒杯用聚乙烯膜覆蓋,阻止培養液蒸發.膜上戳數孔,保持一定的氣體交換.測試液每3d更換1次,投藻密度為(2～3)′105cells/mL.每天早晚間隔12h觀察一次.記錄下每個蚤的第一次產卵時間和第一次產卵數量.F0代產卵后,采用解剖顯微鏡測量產卵后的母蚤體長,復眼的上緣至尾部基端定義為大型蚤的體長.從產下的幼蚤中隨機選擇一個作為F1代,繼續培養.重復上述操作,直到F5代產卵后結束.對沒有在正常時間產卵的大型蚤進行性別觀察,記錄死亡的大型蚤.

1.5 統計分析

采用 SPSS統計軟件進行數據處理,單因素方差分析的方法進行統計學分析.結果用平均值±標準偏差(Mean±SD)表示,處理組與對照組用t檢驗法進行顯著性水平的分析(P＜0.05).

2 結果

磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬的測試液實測濃度值分別為預設濃度的 82.4%～97.3%,95.3%～107%和86.4%～96.7%,與預設值具有較好的一致性,在實驗分析中把預設濃度定為實際暴露濃度.溶解氧保持在(8.6±0.2)mg/L,pH 值為7.9±0.1.實驗過程中,各處理組沒有發現雄性蚤,且大型蚤死亡率均小于10%.

2.1 藥物對產卵時間影響

以大型蚤孤雌生殖世代為橫坐標,以第一次產卵時間為縱坐標,分析磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬單一及復合暴露對產卵時間的影響.與對照相比,磺胺甲惡唑(圖 1a)、氧氟沙星(圖 1b)處理中, 連續6代的大型蚤第一次產卵時間沒有表現出明顯差異性.9.0μg/L和90.0μg/L的布洛芬處理(圖 1c)對大型蚤第一次產卵時間無影響,而900.0μg/L的布洛芬處理總體上延長了第一次產卵時間.與對照相比, F3和F4代產卵時間的延長尤為顯著.在連續6代的培養中,布洛芬對大型蚤第一次產卵時間的影響表現出了一定的濃度依賴性和世代差異性.

對比混合暴露組(圖 1d)與對照組,低濃度(M1)的混合藥物對各子代大型蚤第一次產卵時間沒有顯著差影響,較高濃度(M2和 M3)的混合藥物延長了大型蚤第一次產卵時間,并且 M2處理在F4代表現出顯著差異性,M3處理在F2、F4和F5代表現出顯著差異性.結果表明藥物混合物對大型蚤第一次產卵時間表現出了一定的濃度依賴性和世代差異性.與布洛芬單一暴露相比,混合暴露對子代大型蚤第一次產卵時間的影響表現為受顯著影響子代數增加,并有所提前.基于磺胺甲惡唑和氧氟沙星暴露對子代大型蚤的第一次產卵時間無顯著影響,可以認為混合物中對大型蚤第一次產卵時間的影響主要由布洛芬產生,并因為磺胺甲惡唑和氧氟沙星的存在,增強了這種產卵延遲效應.

圖1 藥物單一及復合暴露對6代大型蚤第一次產卵時間的影響Fig.1 Effects on the age of first reproduction of D. magna exposed to sulfamethoxazole, ibuprofen, ofloxacin and drug mixture for six generations

2.2 藥物對產卵數量影響

與對照相比,3種濃度的磺胺甲惡唑(圖 2a)在 6代中均沒有對大型蚤的產卵數量產生明顯的影響.200.0μg/L的氧氟沙星在F3和F4代顯著降低了產卵數量,但在 F5代又恢復了正常,產卵數量甚至超過了對照.900.0μg/L的布洛芬在F3、F4和 F5代顯著降低了產卵數量.在較高的環境相關濃度下,200.0μg/L的氧氟沙星和 900.0μg/L的布洛芬對大型蚤的產卵數量上表現出顯著的濃度依賴性和世代差異性.

對比混合暴露與對照(圖 2d),低濃度(M1)混合物對各子代大型蚤第一次產卵數量無顯著差影響,較高濃度(M2和 M3)的混合藥物總體上降低了子代的產卵數量.M2處理在F3和F4代表現出顯著差異性.M3處理在F2、F3和F5代表現出顯著差異性.值得注意的是 M2 處理在 F5代又恢復了正常,這種現象類似于 200.0μg/L的氧氟沙星在子代中的表現(圖1d).另外,M3在F4代產卵數有所恢復,但在 F5代又顯著降低.結果表明藥物混合物對大型蚤第一次產卵數量表現出了一定的濃度依賴性和世代差異性.從最高濃度上看,氧氟沙星和布洛芬均在F3代開始表現顯著差異性,混合藥物暴露在F2開始表現顯著差異性,而且受顯著影響的世代增加,說明混合暴露加劇了對產卵數量的影響.

2.3 體長影響

由圖3可見,在連續6代的培養中,磺胺甲惡唑、氧氟沙星、布洛芬單一及混合暴露對大型蚤體長影響不明顯,與對照組比較,無顯著性差異.但在兩個混合暴露M2和M3處理中,隨著培養世代的進行,大型蚤的體長在F3、F4和F5代呈現逐漸下降趨勢,但與對照組沒有顯著差異.總之,在環境相關濃度下,大型蚤體長變化不顯著,表明大型蚤體長不是藥物暴露響應的敏感指標.

圖2 藥物單一及復合暴露對6代大型蚤第一胎產卵數量的影響Fig.2 Effects on the number of offsprings of D. magna exposed to sulfamethoxazole, ibuprofen, ofloxacin and drug mixture for six generations

3 討論

本試驗發現氧氟沙星和布洛芬在環境相關濃度下,對大型蚤繁殖的影響存在世代差異.可能的原因是藥物暴露濃度較低,單代或短時間的暴露對大型蚤繁殖的影響輕微.但是通過連續地世代培養,造成藥物在生物體內累積,產生的生物效應在不斷地進行世代疊加,最終在后代中表現出遲發性慢性毒性效應,因此表現出慢性毒性的世代差異性.藥物對水生動物的慢性毒性的世代差異已有相關報道,Brennan等[20]研究發現暴露于0.2～0.5mg/L的己烯雌酚的大型蚤第二代產仔總量顯著降低,而對第一代產仔總量卻沒有影響.Vandenbergh等[21]研究發現暴露于 0.1,0.32μg/L 17α-乙炔雌二醇的片腳類動物雄性端足蟲(Hyalella azteca)第二代體長明顯小于第一代.本研究發現,在呈現世代差異的各處理組中,除了900.0μg/L的布洛芬自F3代起連續三代顯著影響了大型蚤的第一次產卵數量(圖 1c),其他處理組對大型蚤的第一次產卵時間和第一次產卵數量的影響不具有世代連續性(圖1c、圖1d、圖2b和圖2d),在顯著影響一代或兩代后,有恢復的傾向,其中 200.0μg/L的氧氟沙星和復合暴露M2處理在 F5代的表現尤其明顯(圖 2b和圖2d).Guan等[22]在研究重金屬污染對大型蚤世代影響中也發現類似現象.可能的解釋是大型蚤在連續承受污染物壓力后而在后面世代上產生的一種生殖恢復或生殖補償機制,從而增加后代的存活機率.本研究中,相對于生殖指標,生長指標—體長對藥物暴露響應不敏感.這與Li等[23]的研究類似,低濃度的三唑磷和毒死蜱對大型蚤體長無影響,而對后代數量有明顯的抑制效應.

圖3 藥物單一及復合暴露對6代大型蚤母蚤體長的影響Fig.3 Effects on bodylength of D. magna exposed to sulfamethoxazole, ibuprofen, ofloxacin and drug mixture for six generations

在環境相關濃度下,磺胺甲惡唑對大型蚤各代的第一次產卵時間、第一胎產卵數及母體體長等指標均沒有觀察到明顯變化.Flaherty等[12]也發現暴露于10μg/L磺胺甲惡唑30d后,大型蚤的體長、繁殖力及性別比沒有明顯的差異.多代試驗進一步證明了環境相關濃度下的磺胺甲惡唑對大型蚤的種群發展風險較低,具有較高的生態安全性.相對于磺胺甲惡唑,氧氟沙星和布洛芬對大型蚤的種群發展風險較高.喹諾酮類抗菌藥物能夠抑制主要致病菌的DNA旋轉酶和細菌拓撲異構酶活性[24],在水環境中不易降解[25],被列為基因毒性污染物[26].因此作為喹諾酮類抗菌藥物的典型代表,氧氟沙星可能對大型蚤具有基因遺傳毒性.Parolini等[27]發現 0.2μg/L布洛芬能夠引起斑馬貽貝(Dreissena polymorpha)輕微的細胞遺傳毒性,較高濃度能夠顯著引起基因和細胞傷害.在哺乳動物體中,布洛芬能阻斷多種類花生酸的生成,在炎癥調控、離子傳輸及神經功能中起到重要作用[28-29].近來的研究表明類花生酸在昆蟲的繁殖、免疫反應及溫度調節中起重要作用[30-31].因此,類花生酸在無脊椎動物大型蚤體內的含量及作用,以及布洛芬是否會因影響類花生酸物質的合成而影響大型蚤的生殖和生長值得深入的研究.

以第一次產卵數量和第一次產卵時間作為觀察指標,通過對大型蚤的6代效應研究,得出3種藥物對大型蚤的最高無影響濃度(NOEC)和最低影響濃度(LOEC)(表 2),根據 NOEC和 LOEC的幾何平均值推導出預測無影響濃度(PNEC).參考歐洲藥品局(EMEA)人用藥物環境風險評估指南[32],采用檢測環境濃度(MEC)與預測無影響濃度(PNEC)的比值來評價現實環境中藥物暴露生態風險.本研究得到的3種藥物的MEC/PNEC比值均小于 1,表明目前文獻報道的水體中殘留的磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬對大型蚤種群發展的生態風險較低,具有較高的安全性.

本試驗中,磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬分別以最高無影響濃度存在的復合處理 M2,在某些世代中表現明顯的慢性生殖毒性.各藥物以無影響濃度共同存在時,能夠發現混合暴露影響增強,這種現象也說明不能以單一藥物的 NOEC預測藥物復合污染濃度,藥物混合污染生態毒性預測值得進一步研究.

表2 磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬對大型蚤的生態毒性參數Table 2 Ecological toxicity parameters of sulfamethoxazole, ibuprofen and ofloxacin

4 結論

4.1 通過連續6代的暴露試驗,磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬在環境相關濃度下對大型蚤的生長和繁殖沒有顯著影響.

4.2 隨著暴露濃度的提高,布洛芬和氧氟沙星明顯延遲了大型蚤的第一次產卵時間,減少了第一次產卵數量,而且表現出一定的濃度依賴性和世代差異性.

4.3 藥物混合物對大型蚤繁殖的影響更為顯著.大型蚤體長對藥物暴露(單一或混合)的效應不敏感.

4.4 風險評估結果表明,目前水體中殘留的磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬對大型蚤種群發展的生態風險較低.

[1] Thomas A T. Occurrence of drugs in German sewage treatment plants and rivers [J]. Water Research, 1998,32(11)： 3245-3260.

[2] 計 勇,陸光華.污染水體的總抗氧化能力生物標志物研究. [J].中國環境科學, 2010,30(3)：395-399.

[3] Ellis J B. Pharmaceutical and personal care products (PPCPs) in urban receiving waters [J]. Environmental Pollution, 2006,144(1)：84-189.

[4] Richardson B J, Lam P K S, Martin M. Emerging chemicals of concern： Pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) in Asia, with particular reference to Southern China [J]. Marine Pollution Bulletin, 2005,50(9)：913-920.

[5] Ternes T A, Joss A, Siegrist H. Peer reviewed： scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment [J]. Environmental Science and Technology, 2004,38(20)：392A-399A.

[6] 楊曉凡,陸光華,萬 杰,等.水環境中藥物污染、檢測及去除研究 [J]. 水資源保護, 2012,28(2)：1-7.

[7] 葉計朋,鄒世春,張 干,等.典型抗生素類藥物在珠江三角洲水體中的污染特征 [J]. 生態環境, 2007,16(2)：384-388.

[8] Ginebreda A,Mu?oz I,Alda M L, et al. Environmental risk assessment of pharmaceuticals in rivers： relationships between hazard indexes and aquatic macroinvertebrate diversity indexes in the Llobregat River (NE Spain) [J]. Environment International,2010,36(2)：153-162.

[9] Luo Y, Xu L, Rysz M, et al. Occurrence and Transport of tetracycline, sulfonamide, quinolone, and macrolide antibiotics in the Haihe River Basin, China [J]. Environmental Science and Technology, 2011,45(5)：1827-1833.

[10] Roberts P H, Thomas K V. The occurrence of selected pharmaceuticals in wastewater effluent and surface waters of the lower Tyne catchment [J]. Science of the Total Environment,2006,356(1-3)：143-153.

[11] Ashton D, Hilton M, Thomas K V. Investigating the environmental transport of human pharmaceuticals to streams in the United Kingdom [J]. Science of the Total Environment,2004,333(1-3)：167-184.

[12] Flaherty C M, Dodson, S I. Effects of pharmaceuticals on Daphnia survival, growth, and reproduction [J]. Chemosphere,2005,61(2)：200-207.

[13] Isidori M, Lavorgna M, Nardelli A, et al. Toxic and genotoxic evaluation of six antibiotics on non-target organisms [J]. Science of the Total Environment, 2005,346(1-3)：87-98.

[14] Cleuvers M. Mixture toxicity of the anti-inflammatory drugs diclofenac, ibuprofen, naproxen, and acetylsalicylic acid [J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2004,59(3)：309-315.

[15] Heckmann L-H, Callaghan A, Hooper H L, et al. Chronic toxicity of ibuprofen toDaphnia magna： Effects on life history traits and population dynamics [J]. Toxicology Letters, 2007,172(3)：137-145.

[16] Ahlers J, Riedhammer C, Vogliano M, et al. Acute to chronic ratios in aquatic toxicity—variation across trophic levels and relationship with chemical structure [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2006,25(11)：2937-2945.

[17] Pawlowski S, Aerle van R, Tyler C R, et al. Effects of 17α-ethinylestradiol in a fathead minnow (Pimephales promelas)gonadal recrudescence assay [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2004,57(3)：330-345.

[18] Williams R J, Johnson A C, Smith J J L, et al. Steroid estrogens profiles along river stretches arising from sewage treatment works discharges [J]. Environmental Science and Technology, 2003,37(9)：1744-1750.

[19] Elendt B P, Bias W R. Trace nutrient deficiency inDaphnia magnacultured in standard medium for toxicity testing. Effects of the optimization of culture conditions on life history parameters of D. Magna [J]. Water Research, 1990,24(9)：1157-1167.

[20] Brennan S J,Brougham C A, Roche J J, et al. Multi-generational effects of four selected environmental oestrogens onDaphnia magna[J]. Chemosphere, 2006,64(1)：49-55.

[21] Vandenbergh G F, Adriaens D, Verslycke T, et al. Effects of 17α-ethinylestradiol on sexual development of the amphipod Hyalella azteca [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety,2003,54(2)：216-222.

[22] Guan R, Wang W-X. Multigenerational cadmium acclimation and biokinetics inDaphnia magna[J]. Environmental Pollution,2006,141(2)：343-352.

[23] Li S, Tan Y. Hormetic response of cholinesterase fromDaphnia magnain chronic exposure to triazophos and chlorpyrifos [J].Journal of Environmental Sciences, 2011,23(5)：852-859.

[24] Hooper D C. Quinolone mode of action [J]. Drugs, 1995,49(Suppl 2)：10-15.

[25] Hapeshi E, Achilleos A, Vasquez M I, et al. Drugs degrading photocatalytically： Kinetics and mechanisms of ofloxacin and atenolol removal on titania suspensions [J]. Water Research,2010,44(6)：1737-1746.

[26] Kümmerer K, Al-Ahmad A, Mersch-Sundermann V.Biodegradability of some antibiotics, elimination of the genotoxicity and affection of wastewater bacteria in a simple test[J]. Chemosphere, 2000,40(7)：701-710.

[27] Parolini M, Binelli A, Provini A. Chronic effects induced by ibuprofen on the freshwater bivalve Dreissena polymorpha [J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2011,74(6)：1586-1594.

[28] Charlier C, Michaux C. Dual inhibition of cyclooxygenase-2(COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LOX) as a new strategy to provide safer non-steroidal anti-inflammatory drugs [J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2003,38：645-659.

[29] Funk C D. Prostaglandins and Leukotrienes： Advances in Eicosanoid Biology [J]. Science, 2001,294(5548)：1871-1875.

[30] Stanley D. Prostaglandins and other eicosanoids in insects：biological significance [J]. Annual Review of Entomology, 2006,51(1)：25-44.

[31] Rowley A F, Vogan C L, Taylor G W, et al. Prostaglandins in non-insectan invertebrates： recent insights and unsolved problems[J]. The Journal of Experimental Biology, 2005,208：3-14.

[32] CPMP/SWP/4447/00 (2006),Guidance on environmental risk assessment of medicinal products for human use [Z].