真皮間充質干細胞成骨分化的研究進展

王庭亮 綜述 祝 聯 審校

真皮間充質干細胞成骨分化的研究進展

王庭亮 綜述 祝 聯 審校

骨組織工程技術修復骨組織的缺損顯示了廣闊的應用前景。真皮間充質干細胞 （Dermal mesenchymal stem cells，DMSCs）來源于皮膚組織，易大量獲取，對供區損傷極小，具有包括成骨分化在內的多向分化潛能，有望成為骨組織工程研究合適的種子細胞。我們就真皮間充質干細胞成骨分化的研究進展進行綜述。

真皮間充質干細胞 成骨分化 骨組織工程

因創傷、腫瘤或疾病等各種原因造成的骨缺損，目前一般通過自體骨移植或同種異體骨移植的方法進行修復。但是，自體骨移植對供區損傷大，采骨量有限，難以修復大塊的骨缺損；同種異體骨來源于骨組織庫，骨組織庫是按一定標準和技術選擇供體，收集、加工、滅菌、檢驗、貯存和發放骨組織的機構[1]。骨庫來源骨在治療骨缺損中的療效已經得到廣泛認可，但是異體骨的來源無法得到保障，難以應對日益加劇的臨床需求。

骨組織工程技術修復骨缺損已經顯示了廣闊的應用前景。目前的骨組織工程研究多以骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和脂肪間充質干細胞（Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）作為種子細胞。BMSCs分化能力強，成骨效果確切，但是骨髓組織獲取的量較少，對供者損傷較大。ADSCs同樣具有成骨潛能，可以通過吸脂手術大量獲得，但獲得的細胞群體組成復雜，分離純化難度較大，且個體差異很大。

真皮間充質干細胞（Dermal mesenchymal stem cells，DMSCs）來源于皮膚組織，易大量獲取，對供體損傷極小。研究表明，DMSCs具有包括成骨分化在內的多向分化潛能[2-5]，有望成為骨組織工程研究合適的種子細胞。

DMSCs曾被認為是有多向分化潛能的真皮成纖維細胞亞群[4-7]。但其特性符合國際細胞治療協會推薦的間充質干細胞界定標準，所以將其命名為DMSCs[2，8-9]。

1 真皮間充質干細胞生物學特征

1.1 真皮間充質干細胞的分離與培養

Toma等[10]于2001年首次從小鼠真皮中分離得到一種細胞，將其命名為皮膚前體細胞 （Skin-derived precursors，SKPs）。SKPs與Pittenger等[11]描述的成體間充質干細胞（Adult mesenchymal stem cells，MSCs）特性截然不同，是一種能向神經細胞和中胚層分化的多能非間充質干細胞。Kawase等[12]重復并驗證了Toma等的工作，并進一步證實轉化生長因子β（TGF-β）能促進SKPs的生長，但是TGF-β對神經干細胞并沒有促進生長的作用，表明SKPs與神經干細胞并不相同。Toma等[13]于2005年證實，在人真皮中同樣存在SKPs。這些研究提示了真皮中可能含有復雜的成體干細胞群體。

Bartsch等[2]于 2005年，首次對DMSCs的增殖、體外擴增、多向分化能力進行了詳細的研究。證實DMSCs具有分化為骨細胞、脂肪細胞、肌細胞的潛能，并根據 DMSCs單細胞克隆均保留三向分化潛能，認為DMSCs是由單一細胞系組成。陳付國等[5]對DMSCs分化成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞的三向分化能力進行了闡述，并進行單細胞克隆研究，發現有單向分化、雙向分化和三向分化等不同水平分化潛能細胞存在，認為DMSCs可能是復雜的干細胞群體。

1.2 DMSCs干細胞特征鑒定

1.2.1 DMSCs的自我更新能力

自我更新能力是鑒定干細胞的重要標準之一。干細胞通過不對稱分裂產生子代干細胞和非干細胞成分，子代干細胞維持其復制能力，非干細胞成分則繼續分化。研究發現，DMSCs經100次以上倍增，仍能保留染色體的完整性和多向分化潛能[2]。陳付國等[5]的實驗顯示，體外傳代至15代的DMSCs的擴增能力未見減弱，到達對數倍增期的時間也無顯著改變。另一項對比研究提示，DMSCs的倍增時間短于BMSCs和ADSCs[14]。

1.2.2 DMSCs的多向分化潛能

DMSCs具有向中胚層三大分化方向（骨、脂肪、軟骨）分化的能力。通過單細胞克隆誘導分化，Bartsch等[2]發現單克隆的細胞系均有三向分化能力；陳付國等[4]則發現有單向分化、雙向分化及三向分化等不同水平分化潛能細胞存在，認為Bartsch等獲得的單一細胞系只是細胞群中的一種。但是，Pittenger等[11]在BMSCs誘導分化過程中發現，部分克隆表現出有限的分化能力時，克隆細胞的分裂增殖次數增加，體外培養環境等因素均可能導致這些細胞本來存在的多向分化潛能的丟失。Manini等[15]亦觀察到ADSCs在培養過程中，容易丟失成脂分化能力，但仍保留成骨分化能力，這在某種意義上證實了Pittenger等的推測。由此可以認為，陳付國等發現有不同分化水平的間充質干細胞存在，可能只是培養過程中分化潛能丟失的表現。因此，DMSCs是單一細胞系還是多細胞系，尚需進一步的研究加以證實。

1.2.3 DMSCs表面標志物

Bartsch等[2]對DMSCs進行流式細胞分析顯示，DMSCs表達CD90和 CD105，同時表達中胚層細胞標志 SSEA-4。SSEA-4是一種胚胎早期的糖酯抗原，通常作為未分化的多能胚胎干細胞和囊胚期卵裂胚胎干細胞的表面標志物，可用于鑒定篩選BMSCs[16]，但是用于DMSCs的篩選尚未見報道。陳付國等[4]研究顯示，DMSCs表達的表面標志有 CD13、CD29、CD49d、CD105和Stro-1等；低或不表達CD34、CD45、CD106和CD133等。Lorenz等[6]的實驗顯示，陽性表達CD44、CD71、CD73、CD90、CD105和CD166；CD14、CD31、CD34、CD45和CD133為陰性。Orciani等[17]的結果表明，HLA-A、B、C和CD29、CD44、CD73以及CD90為強陽性，CD105為弱陽性，CD10、CD11b、CD14、CD34、CD49d和HLA-DR為陰性。其中CD34和CD45是造血細胞特異性表面標志物。上述結果均表明，DMSCs不表達CD34和CD45，提示了DMSCs與造血系細胞的不同；而CD44、CD73、CD90和CD105是間充質干細胞相對特異性的表面標志物，均在上述一系列實驗中呈現陽性表達。然而，目前的研究尚未發現DMSCs特異性的表面標志物。值得注意的是，上面的結果與ADSCs表面標志物的表達非常相似[18]。

2 真皮間充質干細胞成骨分化

2.1 DMSCs成骨亞群的分離與純化

從皮膚組織中獲得的DMSCs混雜有大量的其他細胞，另外DMSCs本身也可能是不同分化潛能細胞組成的群體。因此，分離與純化DMSCs具有重要的實際應用價值。陳付國等[5]最早對DMSCs的分離純化進行了探索，但實驗顯示，CD105+細胞并未表現出明顯的增殖和分化優勢。此后，有研究嘗試對不同分化潛能的DMSCs進行差異膜蛋白分析，試圖找到合適的表面標志物以分離具有不同潛能的DMSCs，但未獲得期待的結果[19]。通過研究其他表面標志物，如CD13、CD44、CD54、CD271等，試圖對DMSCs進行分離純化也未獲成功[7，17，20]。He等[14]利用細胞表面骨形成蛋白 I型受體 B亞型（Bone morphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB）對DMSCs進行分離純化，得到BMPRIB+和BMPRIB-兩群細胞，結果顯示前者的增殖和成骨分化潛能明顯優于后者，且前者成骨分化能力與BMSCs相近,表明BMPR-IB可能就是特異性的表面標志物。相關研究已對BMPR-IB在成骨分化中的作用進行了初步探討[21]，但是其機制還需更深入的研究。

2.2 DMSCs成骨分化誘導

2.2.1 生物化學誘導因素

研究顯示，DMSCs同其他成體間充質干細胞一樣，不能夠自行分化為骨細胞，需要外源性誘導分化介質[2，5]。體外成骨誘導介質主要由地塞米松、β磷酸甘油、維生素C組成。地塞米松能增加堿性磷酸酶（ALP）活性和BMP-6基因表達，但持續存在的這些分化促進劑能夠誘導一些間充質干細胞群體的凋亡[22]；皮質類固醇激素在體內能造成骨質疏松等不利于成骨的影響。因此，成骨誘導介質的改進一直是研究的熱點。Hee等[23]發現，1α,25-二羥維生素D3是強有力的誘導成骨分化劑，在DMSCs誘導成骨分化中，維生素D3誘導組產生的ALP活性高于地塞米松組，也高于這兩者共同誘導組，但是在BMSCs中，必須存在地塞米松才能誘導成骨分化。Chevallier等[22]的研究表明，血小板溶解物培養的間充質干細胞（不添加其他成骨誘導介質）在體外能夠自發地誘導成骨基因（如ALP、BSP、OP、BMP-2）的表達，加強成骨分化，并且種植于陶瓷支架上能夠在體內異位成骨。

2.2.2 物理機械誘導因素

物理機械因素對體內骨的形成、保持和更新均有重大影響。Sommar等[24]證實，體外流體剪切力有一定的獨立成骨誘導能力，能夠加強DMSCs的成骨分化。Pre等[25]發現，低振幅的高頻振動可加強ADSCs的成骨分化，并縮短成骨分化時間，并可在無成骨誘導介質時單獨誘導成骨分化。Delaine-Smith等[26]認為，調控體內骨的數量、結構和強度的機械力量主要是振蕩的流體剪切力，他們將化學成骨誘導介質和振蕩的流體剪切力兩者結合，觀察對DMSCs成骨分化的影響，發現I型膠原分泌增加，膠原結構改變，ALP活性增強，礦物質沉積增加等現象。以上研究表明，物理機械因素可能是通過影響細胞骨架結構，改變細胞外基質結構（如膠原結構）的途徑產生某些信號分子或激活某些信號通路，增強其成骨分化能力。

2.2.3 細胞間相互作用

血管生成與成骨是密切相關的，微血管內皮細胞和成骨細胞的相互作用在骨再生過程中極為重要。Laranjeira等[27]將微血管內皮細胞與間充質干細胞按4∶1的比例共培養，結果顯示，ALP、Ⅰ型膠原、RUNX2基因表達和細胞外礦物質沉積均明顯優于單純的間充質干細胞培養，增強了成骨分化；同時，內皮細胞的血管生成基因表達也增強了。細胞共培養體系模擬體內細胞相互作用過程，對骨組織工程體外構建有重要意義，同時有利于保持細胞增殖和分化潛能。

2.3 DMSCs構建骨組織的研究進展

目前，DMSCs作為種子細胞構建骨組織已有了良好的進展。Kang等[9]將豬DMSCs在去礦物質骨和纖維蛋白凝膠支架上共培養，結果表明，去礦物質骨和纖維蛋白凝膠支架復合DMSCs能進行自體骨移植。Sommar等[24]在體外將人DMSCs置于三維大孔徑明膠微載體中培養，并使用流體剪切力進行誘導，顯示出良好的成骨潛能。

3DMSCs與BMSCs、ADSCs成骨分化能力的比較

何金光等[28]通過對人DMSCs、BMSCs、ADSCs的對比研究發現，在定量條件下，DMSCs向成骨細胞分化的能力要弱于ADSCs和BMSCs,認為未經分離純化的DMSCs并不適合作為骨組織工程的種子細胞。但是，通過BMPR-IB分離和純化得到的BMPRIB+細胞群成骨分化能力與BMSCs相近，表現出作為骨組織工程種子細胞的可能性。

4 應用前景

采用組織工程技術構建骨組織，進行用于骨缺損的修復，合適的種子細胞是研究的重點。有研究顯示，DMSCs在體外不刺激T細胞增殖，在體內不引起免疫排斥反應[29-32]。雖然DMSCs的臨床應用還有很多亟待解決的問題，但是作為一種新的種子細胞，DMSCs在骨組織工程乃至整個再生醫學領域可能擁有廣闊的研究及應用前景。

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Osteogenic Differentiation of Dermal Mesenchymal Stem Cells

WANG Tingliang,ZHU Lian.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHU Lian(zhulian6@hotmail.com).

Dermal mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation;Bone tissue engineering

Q813.1+2

B

1673－0364（2013）01－0047－04

2012年10月20日；

2012年11月29日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.01.015

200011 上海市 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科。

祝聯（E-mail：zhulian6@hotmail.com）。

【Summary】Tissue engineered bone showed broad prospects in bone transplantation.Dermal mesenchymal stem cells derived from skin tissue are easy to obtain large volumes,have minimal damages to the donor,have the ability of multipotential differentiation including osteogenic differentiation,and are expected to become the most appropriate seed cells in bone tissue engineering.In this paper,the research progress of osteogenic differentiation in dermal bone mesenchymal stem cells is reviewed.