Hedgehog信號通路與胰腺癌

馬丹 高軍 李兆申

Hedgehog信號通路與胰腺癌

馬丹 高軍 李兆申

胰腺癌是人類最難治愈的致死性惡性疾病之一，5年生存率不到5%，在美國，胰腺癌居癌癥相關死亡的第四位。造成臨床預后較差的部分原因是胰腺癌發生、發展過程中的機制尚未完全清楚。Hedgehog(Hh)信號通路是胚胎發育的主要調控子,其產物控制細胞分化、組織成形和細胞增殖。在成人正常組織中Hh信號通路已無表達或低表達。近年來，研究發現在胰腺癌中Hh信號通路異常是普遍存在的，100%胰腺癌存在Hh信號通路相關分子的基因突變[1]。本文就Hh信號通路的異常激活與胰腺癌的關系做一綜述。

一、 Hh信號通路

Hh信號通路由配體Hh、膜受體Ptch及Smo、核轉錄因子Gli和下游靶基因組成。HH基因于1980年由Nusslein-Vollhard和Wieschaus在研究果蠅的基因突變時發現，該基因突變可以導致果蠅幼蟲發育成刺猬一樣的形態，故名Hedgehog。果蠅中只存在一種HH基因，而在脊椎動物中至少發現3種同源基因，即Sonic hedgehog(SHH)、Indian hedgehog(IHH)和Desert hedgehog(DHH)，分別編碼3種相應的蛋白：Shh、Ihh 和Dhh。膜蛋白受體包括Ptch(Patched)和Smo 受體。Ptch家族是一種十二次跨膜蛋白，起Hh受體作用。Ptch在人類中有2個同源基因：Ptch1、Ptch2分別編碼Ptch1、Ptch2蛋白。二者均能與3種Hh蛋白結合，并且親和力相似。Smo是一種起信號轉導子功能的7次跨膜蛋白。Gli為核轉錄因子，在人類有3種亞型，即Gli1、Gli2 和Gli3，三者功能各不相同。Gli1有激活功能，Gli2 表現為Hh靶基因的激活與抑制子，Gli3也可作為Hh信號的激活子與抑制子，Hh信號通路便是通過調節下游的Gli 轉錄因子控制靶基因的表達的。

初級纖毛是由微管構成的發生于哺乳動物細胞表面的突觸樣結構。很多文獻證實，初級纖毛是Hh信號轉導的必需條件。在哺乳動物細胞中，Hh信號通路的Ptch、Smo及下游轉錄因子Glil、Gli2和Gli3均存在于初級纖毛上。配體激活的Hh信號通路促發SuFu和Gli蛋白復合體發生細胞內易位，最終到達初級纖毛頂部，SuFu的抑制作用解除，Gli被釋放，易位到胞核，作用于靶基因，表明初級纖毛在這一過程中的樞紐地位[2]。另有文獻報道，Hh通路激活的過程如下：無配體時，受體Ptch1定位于初級纖毛，阻止Smo的進入，抑制性Gli蛋白易位到細胞核，無法激活靶基因。配體結合Ptch1后,Hh-Ptch1復合體內在化，Smo易位到初級纖毛，活化性Gli蛋白易位到細胞核，最終靶基因開始轉錄，這些是Hh通路自身成員；另外，眾多與促增 殖(如D-及E-型細胞周期蛋白)、抑制凋亡(如BCL2)或干細胞活化(如NANOG)相關的基因被激活。

二、 Hh信號通路的激活模式

關于腫瘤中Hh通路的激活至少已提出了3種模式。第一種為非配體依賴型模式：Hh通路任一水平發生突變均可以引起腫瘤發生。例如，當通路的負調節因子如Ptch[3-4]基因發生失活突變或功能性缺失或正調節因子如Smo[5]發生功能獲得性突變導致Ptch對其抑制作用失敏均可以激活該通路。第二種模式為配體依賴型模式：認為配體發生異常過表達，以自分泌、旁分泌或逆分泌方式作用于Ptch受體，導致Hh通路的激活。第三種模式為非經典的腫瘤干細胞模式，認為Hh信號的激活存在于腫瘤干細胞(CSCs)內，負責干細胞的自我更新，從而促進腫瘤的增殖、侵襲和轉移[6]。

三、 Hh信號通路與胰腺癌

1．Hh信號通路與胰腺癌的發生、發展：Hh信號通路的激活與胰腺癌有著密切關系。Thayer等[7]發現，在小鼠的發育過程中，Shh的異常表達可引起類似于人胰腺癌的早期病變。在胰腺癌早期及癌前病變階段即可檢測到Hh信號通路的激活。對不同時期的胰腺上皮內瘤變及胰腺癌進行分析，發現隨著上皮內瘤變向胰腺癌的逐步發展，病變組織中Hh信號通路成員的表達水平也急劇上升。對54例胰腺癌標本進行檢測，發現Ihh、Ptch、Smo蛋白均呈高表達，相應癌旁組織中只有胰島細胞表達，在正常胰腺導管組織中均未見表達[8]。Quint等[9]發現，Shh、Ptch和Glil蛋白在胰腺癌組織中呈低到中度表達；在胰腺上皮內瘤變中，隨著病變進展，Shh，Ptch和Gli1蛋白的表達量呈非線性增加； Shh、Ptch和Gli1蛋白的表達與臨床病理特征(如淋巴結轉移，腫瘤大小)存在顯著的相關性。綜上所述，胰腺癌組織及其癌前病變中存在Hh通路的異常激活，Hh通路參與了胰腺癌的發生、發展。

2．Hh信號通路與胰腺癌腫瘤相關間質：近年來，胰腺癌與其周圍間質的相互作用受到廣泛關注，其中Hh信號通路也發揮重要作用。研究證實Shh是引起胰腺癌中結締組織反應的重要遞質，主要由腫瘤細胞分泌，以旁分泌作用模式促進腫瘤間質的形成，同時也作用于胰腺癌間質細胞[10]。胰腺導管腺癌(PDAC)的特征之一是癌旁結締組織增生，這是上皮組織來源的Hh配體旁分泌作用于間質引起的。胰腺上皮癌細胞可能通過分泌Hh配體激活了胰腺星狀細胞(PSCs)，而它又分泌了一些可溶性因子反作用于癌細胞，增加其活性[11]。Olive等[12]證實Hh的小分子抑制劑可以引起明顯的間質消退，提高原位胰腺癌小鼠模型的給藥效率。同樣，Lauth等[13]最近發現了在腫瘤相關間質細胞中存在Hh通路目的基因Gli1過表達，而在腫瘤中表達極少，與Hh通路在間質高活性而在腫瘤低活性一致。Shh誘導的旁分泌信號還可通過初級纖毛中的功能復合體引起間質分子改變(VEGF、MMP9表達上調)，促進血管生成、淋巴管生成和腫瘤轉移[14]?？傊?，Hh信號通路通過腫瘤間質相互作用提供有利于癌細胞生長的微環境從而加速胰腺癌的發生。

腫瘤微環境是由細胞外組分構成的致密混合物，包含細胞外基質(ECM)、成纖維細胞、PSCs、炎癥細胞、機制金屬蛋白酶等。其中，PSCs被認為是ECM的主要來源細胞，腫瘤來源的Hh信號可以作用于PSCs，而PSCs對胰腺癌細胞也有反作用。體內實驗已證實PSCs對胰腺癌有促進作用。PSCs可使胰腺癌細胞株的遷移明顯增加，并促進其增殖、抑制凋亡；在動物模型上，共注射PSCs和胰腺癌細胞后，腫瘤生長更快，局部播散發生率增加，肝轉移發生率也增加[15]。以上研究證實，Hh通路通過介導腫瘤間質相互作用，促進胰腺癌的發展。

3．Hh信號通路與胰腺癌干細胞：腫瘤干細胞(CSCs)與腫瘤的發生、侵襲、轉移及腫瘤的放化療耐藥性密切相關。研究發現Hh通路參與了CSCs的功能維持、自我更新等過程，Hh通路的異常活化可以引起CSCs的增殖和腫瘤的復發。胰腺癌患者體內分離出的CD44+CD24+ESA+CSCs中Shh的表達明顯高于其陰性三倍體對照[16]。Gli1的表達也與CSCs的代表特征之一——化療抵抗性有關[17]。另外，體內和體外實驗發現，Smo抑制劑可以促進CD133+胰腺癌干細胞的消退[18]。環巴明也可以通過阻斷Hh通路抑制胰腺癌干細胞的自我更新[19]。

4．Hh信號通路與上皮間質轉化：上皮間質轉化(EMT)的特點是上皮標志性蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等表達降低并定位于細胞膜上，以及間質標志性蛋白波形蛋白等表達增加。EMT可以增強腫瘤的侵襲力，促進腫瘤的轉移和發展。近年來，研究提示Hh通路可以誘導腫瘤的EMT過程。

EMT過程中的重要轉錄因子Snail可能為Glil蛋白的下游轉錄調控靶點。Li等[20]研究發現，Hh信號通路轉錄因子Gli1通過誘導Snail的活性，從而抑制E-cadherin的表達，誘導EMT發生，促進腫瘤侵襲和轉移。Feldman等[21]也報道胰腺癌中Hh通路下游因子Gli1過度表達可促進Snail表達上調，使E-cadherin表達明顯下調，促進EMT的發生，導致腫瘤細胞侵襲性和轉移性增高；使用環巴明后，Snail水平明顯下調，而E-cadherin表達水平明顯上調，腫瘤的侵襲能力明顯減弱。通過Shh基因敲除或使用Hh通路抑制劑可以削弱腫瘤中具有EMT表型的細胞的侵襲力[22]，也提示Hh通路的活化可以誘導EMT及其后的癌細胞侵襲。另外，Shh基因敲除也可以明顯抑制TGF-β1誘導的EMT過程[22]。使用Hh通路抑制劑可以逆轉細胞的EMT表型，表現為間質標記物ZEB1及纖連蛋白減少，上皮標志性蛋白E-鈣連素增加[22]。許多研究也發現Hh通路與TGF-β、Notch、WNT和Ras通路及生長因子受體可能共同參與EMT過程。這些結果證明Hh信號通路活化與EMT表型的獲得及腫瘤侵襲有關。

5．胰腺癌中Hh信號通路與其他通路的相互作用：Hh通路與許多通路之間存在交叉對話，構成一個龐大精密的網絡調控胰腺癌的發生、發展和轉移等過程。

TGF-β激活激酶-1(TAK1)是MAPK家族成員之一，也是炎癥免疫、應激反應及腫瘤發展過程中許多信號轉導連鎖反應的關鍵調控因子，它可以通過激活細胞外激酶如p38MAPK、JNK及IKK最終誘導轉錄因子NF-κB活化。研究發現，TAK1通過活化NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)參與胰腺癌對化療藥物的耐受性，基因沉默或抑制TAK1是逆轉胰腺癌內在耐藥性的有效方法[23]。TAK1的泛素化也參與調控抗腫瘤藥物阿霉素誘導的NF-κB活化，從而影響阿霉素的抗癌作用。TAK1參與多種形式的NF-κB活化。TAK1對于TNF-α[24]及基因毒性因素誘導的NF-κB活化都具有調控作用。而Shh是NF-κB的直接轉錄靶點。研究發現NF-κB p65和Shh在胰腺癌組織標本中的表達呈顯著正相關，阻斷NF-κB可以抑制Shh mRNA的表達[25]。某些炎性因子(如IL-1β、TNF-α等)可通過激活NF-κB導致Shh的過度表達，進而激活Hh信號通路，并影響細胞周期蛋白的表達，促進胰腺癌細胞的增殖。以上研究提示，在胰腺癌中TAK1-NF-κB的激活是引起Shh高表達的機制之一，TAK1-NF-κB引起胰腺癌細胞增殖一定程度上是通過Shh高表達實現的，兩條通路間存在相互作用。

腫瘤相關巨噬細胞(TAM)是腫瘤微環境的重要成分之一，在胰腺癌的發展進程中也發揮重要作用。依據激活方式的不同，分為M1和M2型TAM，近年來，M2型TAM在胰腺癌進展中的作用受到研究者的重視。M2型TAM影響PDAC淋巴轉移，與其預后相關，抑制TAM與癌細胞的相互作用可以改善患者預后[26]。之后，又有文獻報道M2型TAM與胰頭導管腺癌的腫瘤大小、淋巴結轉移和預后不良相關[27]。TAM促進胰腺癌發展的機制之一便是TAM中NF-κB活化，可以促進促腫瘤因子的分泌，從而影響腫瘤的發展。有研究者提出設想，在炎癥刺激如LPS作用下，NF-κB誘導TAM活化，直接或間接通過Shh的分泌誘發和促進PDAC的發生[28]。以上研究提示，TAK1-NF-κB、TAM、Hh通路在胰腺癌的發生中都發揮重要作用，在這個過程中三者之間相互作用，組成復雜的環路而參與胰腺癌的進展。

Pasea di Magliano等[29]采用一種可特異性激活胰腺上皮細胞中Hh信號通路的小鼠模型研究胰腺癌的發病機制，發現小鼠生長到成年后可形成胰腺未分化癌，通過激活Ras信號通路可進一步誘導形成胰腺上皮內瘤變并提高腫瘤致死性，提示特異性激活胰腺上皮細胞中Hh信號通路可以誘導胰腺瘤變。Ras和Hh信號通路共同參與胰腺導管腺癌的形成。研究證實，Ras通路異常通過RAF/MEK/MAPK級聯反應促發上皮內瘤變及晚期胰腺癌Hh通路的活化。另外，Shh可以減少腫瘤細胞對活化的Ras信號的依賴性[30]。

Yamazaki等[31]用Shh轉染的胰腺癌細胞的上清液培養內皮前驅細胞，結果發現其可誘導血管內皮生長因子(VEGF)、間質細胞衍生因子-1(SDF-1)和血管形成素-1(Ang-1)mRNA表達水平的上調，但以上這些生長因子與Hh信號通路相互作用的具體機制尚待進一步研究。采用靶向Shh的治療既可以抑制腫瘤細胞的增殖，也可以抑制腫瘤血管的生成。但也有報道使用Hh通路抑制劑有促進腫瘤血管生成的作用[11]，這個問題還有待進一步研究。

在胚胎發育時期，Notch信號通路和Hh信號通路共同參與調控胰腺發育，Shh的表達與否決定了細胞發育的終點；Notch 信號通路與胰腺前體細胞的自我更新和分化相關。Notch信號通路的異常激活可影響胰腺前體細胞向各種胰腺細胞系的發育。在成熟胰腺組織中，以上兩種信號通路都處于失活狀態，二者的異常激活將導致胰腺癌的發生。

在腫瘤干細胞中存在著一個由Hh、BMP /TGF-β、FGF、WNT和Notch信號通路共同構成的信號網絡，在胰腺癌發生中發揮關鍵作用。而上述通路的協同作用在EMT過程中也發揮重要作用。

上述研究提示，Hh通路與其他通路存在廣泛的相互作用，共同促進胰腺癌的發生、發展。

四、阻斷Hh信號通路在胰腺癌治療中的研究

Hh信號通路與胰腺癌的發生、發展、侵襲和轉移關系密切，理論上，阻斷Hh是胰腺癌治療的有效途徑。近年來，一些Hh通路的小分子抑制劑已用于實驗室或臨床研究，包括阻斷Shh和受體結合，如Robotnikinin、Shh抗體5E1；拮抗Smo，如環巴明(cyclopamine)、KAAD-cyclopamine、SANTs1-4、Cur-61414、GDC-0449、BMS-833923、IPI-926、LDE-225和PF-0444913等；作用于Smo下游位點，如HPI1-4、GANT-58 和GANT61等[32]。在這些抑制劑中，許多成員對腫瘤的抑制作用已得到證實。環巴明可以逆轉Hh信號通路依賴性細胞株對吉西他濱的耐藥性，并下調這些細胞株CSCs標志物的表達。環巴明也可以抑制胰腺癌細胞株snail、E-cadherin上調，抑制EMT，并伴有原位瘤明顯縮小[33]。IPI-926可以誘導胰腺癌小鼠模型間質的消退，提高吉西他濱化療藥物的療效[12]。smo的抑制劑AZD8542通過阻斷Hh信號通路作用于小鼠腫瘤模型的腫瘤相關間質，抑制腫瘤增殖和轉移[11]。

但這些藥物的不良反應也不容忽視，所以一些相對無毒副作用的天然制劑引起了研究者的注意，如大豆異黃酮、白藜蘆醇、綠茶多酚、姜黃素、維生素D等，它們可以有效阻斷Hh信號通路及其他通路，阻止胰腺癌的進展[34]。這些營養制劑可以與傳統的化療藥物聯合應用，提高腫瘤治療的效果。

Hh信號通路的激活在胰腺癌中是廣泛存在的，與胰腺癌的發生、發展、侵襲、轉移相關。Hh信號通路抑制劑對胰腺癌的抑制作用也得到證實，但是，研究顯示單一靶點Hh通路抑制劑治療后存在快速耐藥現象，提示Hh通路抑制劑的聯合應用是更合理的選擇。另外，我們應該注意，Hh通路與眾多其他通路存在交叉對話。除了經典的激活方式，其他通路也可以介導Hh通路的活化。這種情況也造就了Hh通路抑制劑的獲得性耐藥，所以，Hh與其相關通路的聯合靶向治療有望為胰腺癌的治療提供新的策略。在不同的腫瘤個體，發病的分子機制可能有所不同，因此，通過基因測序、免疫共沉淀等手段明確這些個體中Hh通路及其他通路的活化狀態，進而進行分子分型，確定個體化的治療方案，將是未來胰腺癌治療的關鍵。

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(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.01.020

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李兆申，Email： zhsli@81890.net

2012-11-26)