P-糖蛋白及其逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性的研究進展

王清 劉倩 張學梅

（大連大學醫學院，遼寧大連116622）

P-糖蛋白及其逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性的研究進展

王清 劉倩 張學梅

（大連大學醫學院，遼寧大連116622）

隨著化療藥物的廣泛使用，腫瘤多藥耐藥性是導致化療失敗的主要原因之一。而P-糖蛋白（P-gp）介導的多藥耐藥性已成為目前的研究熱點，本文就P-gp的結構、組織分布、P-gp介導的腫瘤細胞的多藥耐藥性及其逆轉的研究現狀作一綜述。

P-糖蛋白；腫瘤細胞；多藥耐藥性

在目前的腫瘤治療過程中，經常會出現這樣的情況，有些腫瘤在經歷最初的化療后仍會復發，可能的一種原因是腫瘤細胞對化療藥物產生了多藥耐藥性（MDR）導致化療失敗。MDR是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現耐藥的同時，也會對多種結構不同、作用機制不同的化療藥物產生耐藥性的現象，這是一種獲得性耐藥。在1976年，Juliano RL和Ling V證明了MDR現象的存在與細胞膜表面的一個170 kDa的糖蛋白有關，因其能夠降低藥物的細胞通透性，故命名P-糖蛋白（P-gp，也稱為多藥耐藥蛋白）[1]。很快發現，P-gp需要依靠能量將藥物從細胞中去除，即它是一種腺苷三磷酸（ATP）依賴性外排泵。隨著對P-gp的進一步研究，發現其不僅在人體正常組織表達，也在許多哺乳動物和人類組織的培養細胞包括各種腫瘤細胞表面表達。而且人類幾乎所有的腫瘤細胞都有不同程度的P-gp表達，但對化療不敏感或療效差的腫瘤細胞往往有較高水平的P-gp表達[2]。因此P-gp介導的腫瘤細胞MDR已成為目前的研究熱點之一。本文就P-gp的基本研究及其逆轉腫瘤細胞MDR的研究進展作一綜述。

1 P-gp的組織分布和生理特性

盡管P-gp在大部分人類和嚙齒動物組織中的表達水平很低，但發現其在具有排泌作用的大腸、小腸、肝膽管和腎近端小管的上皮細胞表面有很高的表達量。而且在腎上腺、胎盤和大腦等組織器官也發現了這種轉運體。在大腦中，P-gp主要分布于腦毛細血管內皮細胞形成的一個連續的單分子層即血腦屏障中，它不僅可以阻止血液里的藥物成分進入中樞神經系統，還可以參與腦外源性物質外排入血液循環，因此P-gp是限制藥物等外源性物質進入腦的一個重要影響因素[3]。同樣，它也可以保護胎兒和其他敏感組織，避免各種內源性和外源性毒素的侵襲。為進一步驗證P-gp的功能，制備并觀察P-gp基因敲除小鼠，這些小鼠壽命正常，健康，生殖能力正常，然而當給予藥物時，與野生型鼠相比其腦部藥物的積累將達到很高的水平，產生一定的神經毒性。例如，P-gp基因敲除的小鼠對伊維菌素和莫昔克丁的藥物敏感性均有提高[4]。

眾所周知，P-gp可以影響許多臨床藥物的特性，在藥物的吸收、分布、代謝、排泄方面有很重要的作用。在小腸中，P-gp作為一個泵可將藥物外排入腸腔中，降低了藥物的吸收和口服生物利用度。據預測，P-gp基因敲除的小鼠表現出從消化道攝取藥物的能力明顯增強，并能顯著減慢藥物從血液循環的消除，也能導致一些藥物突然出現藥物毒性[3]。這說明P-gp基因敲除小鼠在識別和證明藥物在體內分布代謝方面具有很大的作用，因此可以利用基因敲除小鼠模型進行相關研究。

為保護機體免受外源物質的損害，P-gp在運輸內源分子和代謝產物時也起了很重要的作用[5]。常見的內源性分子包括磷脂質、糖脂、血小板活性因子、β-淀粉樣肽以及一些白介素類的細胞因子等。P-gp也可運輸一些類固醇激素，如腎上腺分泌的醛固酮和子宮上皮分泌的黃體酮等。但是目前對于體內的這些內源性分子的P-gp轉運體的信息是很少的。

2 P-gp的結構和對功能的影響

P-gp是一種 ATP依賴性跨膜轉運蛋白，是ABC轉運蛋白超家族成員之一，也是目前研究最多和了解最清楚的轉運體。P-gp位于7號染色體長臂2區1帶，由MDR基因1（MDR1）編碼，是一個分子量為170 kDa的糖基化細胞膜蛋白。盡管其三維晶體結構尚未確定，但將它和其他ABC家族進行基因序列比較，發現它由兩個同源的單體組成，每個單體包括1個含6個跨膜α螺旋的疏水性跨膜區（TMD）和1個位于胞漿內的ATP結合區也就是核苷酸結合區（NBD），這兩個單體組合成位于細胞膜上的一個能量依賴性泵。近年來發現P-gp有多種的拓撲結構，這些不同的拓撲結構可能反映了其本身存在的多種結構，也可能反映其在藥物運輸中的不同構象，這都值得進一步研究[6]。

目前認為P-gp在分解ATP供給能量的同時，可以將腫瘤細胞內部的親脂性化學藥物排到細胞外，致使細胞內藥物濃度低于殺傷濃度而使腫瘤細胞產生MDR，因此一些親脂性藥物可以競爭性抑制P-gp外排化療藥物的功能。同時P-gp誘導的MDR腫瘤中可同時檢測到高水平的蛋白激酶C（PKC），PKC主要通過磷酸化P-gp藥物結合位點的絲氨酸而增強其外排化療藥物的功能[7-8]。

P-gp也可與一些與其功能上不相關的復合物發生相互作用，包括化療藥物、類固醇、線形或環形多肽、熒光染料、親離子基等，這些復合物的結構大多是含有苯環而且是相對疏水性的。然而，只有少數的受體可以直接檢測到，大多數是通過細胞過表達P-gp識別的。

3 P-gp與腫瘤MDR

研究表明：許多腫瘤原發性或獲得性耐藥均與 P-gp高水平表達密切相關[9-10]。基于對正常組織中P-gp表達水平的研究，人們根據腫瘤組織不同的P-gp表達水平，可將腫瘤分為三大類：第1類為化療前就高水平表達P-gp的腫瘤群，而且這些腫瘤一般起源于高度或中度表達P-gp的正常組織或器官，臨床表現為原發性耐藥，包括肝癌、胰腺癌、腎癌、結腸癌等；第2類為中度水平表達P-gp的腫瘤，包括乳腺癌、軟組織肉瘤、神經細胞瘤等，該類腫瘤最初對化療敏感并可達到完全緩解，但復發率較高而且易產生獲得性耐藥；第3類則為P-gp表達水平較低或檢測陰性的腫瘤，如頭頸部癌、非小細胞肺癌、急性白血病等，它們對化療藥物極為敏感，一般效果顯著，但和第2類相似，也易產生獲得性耐藥。因此在化療前后檢測病人腫瘤組織的P-gp表達情況不僅可以根據腫瘤對化療藥物的敏感度有針對性地選擇化療藥物，也可以根據治療過程中P-gp水平的變化判斷是否發生MDR，以便及時調整化療方案，而且某些腫瘤P-gp的水平還可以作為一項預后檢測指標。所以在臨床治療過程中檢測P-gp表達水平具有一定的意義。

在腫瘤治療過程中化療藥物是引起 P-gp過表達的一個重要原因，同時化療過程中的輔助用藥也可誘導P-gp的過表達，這就加大了腫瘤細胞產生MDR的發生率。如通過抑制P-gp的過表達來逆轉腫瘤細胞的MDR，將大大提高臨床惡性腫瘤化療的治療效果。目前針對P-gp介導的MDR的逆轉研究主要圍繞著以下幾個方面。

3.1 P-gp抑制劑

P-gp抑制劑作為逆轉的一種方法，已被廣泛深入研究，根據其研發的時間順序分為三代。20世紀80年代生產了第1代P-gp抑制劑，如免疫抑制劑環孢素A等；鈣通道阻滯藥維拉帕米等；鈣調蛋白阻滯藥氯丙嗪等，它們均為親脂性化合物，可通過與化療藥物競爭性或非競爭性結合P-gp，抑制其跨膜泵作用，減少化療藥物的外排。但是它們與P-gp的結合特異性非常低，而且需要增大應用劑量才能達到抑制P-gp的功能，這對人體將產生很強的毒副作用，而某些逆轉劑本身就是體內其他轉運系統和酶系統的底物，這樣會干擾體內的一些正常代謝，特別是與化療藥物之間可產生藥物代謝動力學方面的影響。這在很大程度上限制了它們的臨床應用[11]。

第2代P-gp抑制劑是在第1代抑制劑結構的基礎上改造合成的，主要包括PSC-833（環孢素D衍生物）、Biricodar和 VX-710等，雖然它們和P-gp親和力更強，并且沒有免疫抑制副作用，細胞毒性副作用也較低；但是它們缺乏特異性，同樣抑制正常組織P-gp功能，而且還抑制細胞色素P450 3A的功能，影響藥物代謝[12]，因此它們的研究也受到一定的限制。

以 tariquidar、OC144-093、zosuquidar、elacridar為代表的第3代P-gp抑制藥物對P-gp親和力更高，而且對依賴細胞色素P450 3A的藥物代謝影響很小[13]，然而它們在達到抑制 P-gp功能劑量時，仍有一定的細胞毒性，目前 tariquidar、zosuquidar等第 3代 P-gp抑制藥物還處于臨床試驗階段[14]。腸上皮細胞中的P-gp是影響新藥研發的一個重要問題，因其可導致新藥物的吸收不良，從而使臨床治療無效。現在許多制藥公司通常將檢測藥物與P-gp的相互作用作為其藥物研發過程中的一部分。而目前的P-gp抑制劑在治療癌癥的臨床試驗中的結果是令人失望的[15-16]，可能是因為這些研究受到了一定的限制，如病人選擇標準限制等。此外，目前的研究對探索應用食物或植物的天然成分作為P-gp抑制劑有很大興趣，這可為第4代產品的發展提供一個有用的指導[16]。

3.2 抑制P-gp表達

除了上述的藥物抑制劑外，還可以通過抑制P-gp的表達來逆轉腫瘤細胞的MDR。除了化療藥物和輔助藥物可以誘導P-gp的表達外，腫瘤細胞的某些生物學改變也會影響P-gp的表達。已經發現P-gp在轉錄水平受多種信號機制調節，如缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）[17]、p53[18]、染色體重排[19]、基因的甲基化修飾及乙酰化修飾等[20-21]；轉錄后受微小RNA（microRNA）調節[22-23]，這些信號的改變最終都會影響 P-gp的表達水平。

而拮抗P-gp表達最直接的方法就是反義核酸技術，如反義寡核苷酸技術、反義RNA技術、核酶技術等。反義寡核苷酸是一類廣泛存在于生物體的基因調控分子，能通過堿基對與互補鏈雜交，特異地與靶細胞mRNA結合，阻止mRNA的轉錄、翻譯，使蛋白質表達受阻，從而逆轉腫瘤的MDR。Nadali F[24]等利用反義寡核苷酸在轉錄水平逆轉了白血病細胞的MDR。但是反義寡核苷酸容易發生降解，以致作用短暫。核酶是正常存在于細胞內的一類具有RNA限制性內切酶活性的小分子RNA，它能與靶RNA分子特定位點特異結合，切割阻斷目的基因的表達，因此可以設計針對MDR1基因的核酶，使其在特定位點對靶RNA進行切割，阻斷P-gp的形成，從而逆轉MDR。目前在下調 P-gp表達方面，研究較多的是 RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術，其基本原理是內源性或外源性雙鏈短RNA與細胞內切酶形成誘導沉默復合體 （RNA induced silencing complex，RISC），然后以干擾小RNA（siRNA）為模板，特異識別與其同源的靶mRNA，誘導其產生特異性降解，從而抑制基因表達。siRNA是一段長為20～25個核苷酸組成的雙股RNA，具有很高的特異性，既不影響其他蛋白表達，也不會影響體內的藥物代謝動力學，在逆轉腫瘤MDR方面具有獨特的優勢。近年來，關于P-gp siRNA在逆轉腫瘤細胞MDR方面的研究也比較多[25-27]，也得到肯定的結果，為逆轉腫瘤MDR開辟了新的途徑。

3.3 基因工程抗體

抗 P-gp單克隆抗體也可以作為抑制腫瘤MDR的藥物[28]。單克隆抗體可特異性結合P-gp抗原表位，且不會影響細胞色素P450 3A依賴的藥物代謝。目前通過基因工程手段已經可以制備人源化單克隆抗體、完全人源抗體、小分子人源抗體等。例如：以耐藥細胞或耐藥組織細胞膜蛋白作為抗原，篩選通過噬菌體展示技術制備的小分子抗體庫，從庫中篩選出抗P-gp的小分子人源抗體，可特異性識別、結合P-gp的胞外膜部分，從而逆轉MDR。將具有細胞毒性的化療藥物與小分子抗體相連，借助抗原抗體結合的特性可實現藥物的靶向運輸，因小分子抗體的分子量小，在體內更容易進行跨膜轉運，從而深入到表達P-gp的腫瘤組織中，同時其代謝速度快對正常的組織細胞影響小，而且人源小分子抗體在逆轉腫瘤MDR的同時不會引起機體的變態性免疫反應，從而實現在取得良好的靶向化療治療效果的同時，將不良反應控制在最低水平。抗P-gp的小分子抗體無論是在制定化療方案前對個體是否產生MDR的診斷上，還是在已產生MDR的個體治療上，都具有深遠的開發和應用前景及較高的應用價值。

4 展望

腫瘤細胞MDR已成為腫瘤病人化療失敗的主要因素，目前研究已經證明腫瘤細胞出現MDR多與P-gp過量表達有關，它已成為腫瘤化療的最主要障礙之一。通過競爭性或非競爭性抑制P-gp功能，或直接降低P-gp的表達來逆轉腫瘤細胞的MDR具有重要的臨床應用意義。現在使用的逆轉劑大多副作用比較大，臨床應用受到很大限制，隨著分子生物學技術的飛速發展，將來可能找到更多的辦法來克服腫瘤的耐藥性，更好地指導臨床化療，使腫瘤的治療取得突破性的進展。

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P-glycoprotein and the Research Progress on Reversal of P-glycoprotein-mediated Multidrug Resistance of Tumor Cells

Wang Qing，Liu Qian，Zhang Xuemei
（Medical College of Dalian University,Liaoning Dalian 116622，China）

With the wide use of chemotherapy drugs，multidrug resistance （MDR）is considered as one o f the major reasons causing chemotherapy failure.The multidrug resistance mediated by P-glycoprotein （P-gp）has recently become a hot research topic.This paper briefly introduced the structure and organization distribution of P-gp and the research progress of P-gp mediated multidrug resistance of tumor cells and its reversal strategy.

P-glycoprotein（P-gp）；Tumor Cell；Multidrug Resistance（MDR）

10.3969/j.issn.1672-5433.2013.03.009

2012-09-06）

國家科技支撐計劃項目課題（2009BAK61B04）

王清，女，在讀碩士。研究方向：基因工程抗體。E-mail：wangqing_5566@163.com

張學梅，女，副教授，碩士生導師。研究方向：基因工程抗體和糖尿病發病免疫學機制研究。通訊作者E-mail：zhangxue_m@163.com