乙型肝炎病毒基因分型方法的研究進展

倪曉艷 曹 文

（遼寧省東港市中醫院檢驗科，遼寧 東港 118300）

乙型肝炎病毒基因分型方法的研究進展

倪曉艷 曹 文

（遼寧省東港市中醫院檢驗科，遼寧 東港 118300）

目的 為建立一種快速、直接、簡單以及經濟的乙型肝炎病毒基因分型的方法，并且能夠便于大批量的標本檢測。方法 從前S1基因到S基因中的序列設計出10條內外引物，并將其中4條內引物擴增A B C 型乙型肝炎病毒，然后將第2 輪PCR的產物用1.5%瓊脂糖進行電泳，根據凝膠成像分析系統所顯示的PCR產物片斷大小直接判定HBV基因型。結果 本文應用乙型肝炎病毒PCR分型方法，結果可靠。檢測以基因C型為主，與文獻報道結果一致。PCR擴增結果顯示，200例HBV DNA基因分型：B型28例（14%），C型169例（84.5%），B、C混合型1例（0.5%），兩例基因型不明。重復性試驗：基因分型鑒定結果前后符合率為100%。結論 我們采用型特異性引物經兩輪PCR分別擴增A-C型HBV，從PCR 產物片段的大小即可直接判定HBV 基因型，此方法特異性高，簡單，容易操作等。

乙型肝炎病毒基因；基因型；PCR擴增

HBV在漫長的歲月中累計的點突變構成不同的基因型，基因型的提出為HBV的研究開辟了新的領域[1]。本實驗采用型特異性引物PCR擴增法對200例江浙滬地區乙型病毒性肝炎患者進行了HBV基因分型，并采用瓊脂糖凝膠電泳方法對擴增產物進行分型，根據凝膠成像系統對所得圖像進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗標本血清

收集2009年3月至2009年4月杭州迪安醫學檢驗中心PCR科室篩選的乙型肝炎病毒陽性的標本200例（此標本由羅氏LightingCycler480高通量實時熒光定量PCR儀檢測出HBV DNA＞1×103copy/ml）。

1.1.2 基因提取、擴增和電泳主要試劑

血清DNA提取所用試劑購自上海克隆生物高技術有限公司；PCR反應體系由迪安科研部自備，其中Taq酶與MgCl2購自Fermentas公司，dNTP則購自Keygene公司；引物由上海英駿（invitrogen）生物技術有限公司合成，瓊脂糖購自北京凌峰源生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

HB-100恒溫金屬浴儀為杭州博日科技有限公司產品，PCR儀為杭州朗基科學儀器有限公司生產的LongGene-MG96G型，離心機為貝克曼（BeckMan）公司的Microfuge I6，電泳儀為上海復生生物工程研究所生產的FS-600，全自動數碼凝膠成像分析儀為上海培清科技有限公司生產的JS-380C。

1.2 方法

1.2.1 標本準備

杭州迪安醫學檢驗中PCR科室的對常規血清標本用羅氏LightingCycler高通量實時熒光定量PCR儀檢測，檢測陽性標本送科研室進行乙型肝炎病毒分型實驗。

1.2.2 血清DNA模板提取

按照試劑盒說明書進行，主要步驟為：取50μL待測血清樣本加入50μL核酸提取液A，振蕩混勻10min，12000rpm離心10min，棄去上清；再加入50μL核酸提取液B至沉淀中，振蕩混勻10s，100℃金屬浴10min，12000rpm離心2 min，取2μL上清液作為模板。

1.2.3 PCR擴增

PCR 按Naitoetal[2]方法進行稍作改動。首先用一對外引物（P1、Ps）進行第1輪PCR，在0.2mLPCR管中依次加入通用引物P1（10 μmol/L）0.8μL，Ps（10μmol/L）0.8μL，dNTP（10mM）0.8μLTaq 聚合酶（1μ/mL） 0.4μL，10×PCR 緩沖液（含20 mM Mg2+） 2.5μL，血清DNA提取物1μL。擴增條件為94°C 預變性5min，94°C 變性60s，55°C退火45s ，72°C延伸90s，30個循環后72°C再延伸5 min。然后分別以B2、BA1R、BB1R、BC1R為內引物進行第2 輪PCR，分別檢測A型、B型和C型乙型肝炎病毒。第二輪乙型肝炎病毒PCR 反應體系中除引物外的其余成分同第1輪PCR，擴增條件為95°C預變性10min ，94°C變性20s，58°C退火20s，72 °C延伸30s，40個循環后72°C再延伸10min。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳及數據分析

用微量加樣器將DL2000 marker 5μL、PCR產物8μL及陰性對照和空白對照分別加樣于1.5%瓊脂糖凝膠，進行電泳。

2 結 果

用特異性引物可分出乙型肝炎病毒 DNA片斷分別為281bp和122bp的HBV DNA B型和C型，，同時出現281bp和122bp條帶者為BC混合型。

2.1 200例HBV DNA基因分型

B型28例（14%），C型169例（84.5%），B、C混合型1例（0.5%），兩例基因型不明。

2.2 重復性試驗

200份患者血清中隨機挑選20份，多次應用方法分型，基因分型鑒定結果前后符合率為100%。

3 討 論

HBV 基因型與乙肝的傳染性、臨床疾病預后判斷及抗病毒藥物治療的選擇具有一定的相關性，因此對HBV基因型的檢測意義重大。目前現有的分型方法尚有些許不足如直接測序法相對最為準確，但測序時間長、成本高、需反復比較分析才能得出結論，無法進行大樣本量的流行病學研究[3]；一般的PCR-RFLP分型法大多也是擴增后再測序比直接測序法也只稍微節省成本，而且此法所需時間較長，步驟多，混合感染或酶切不完全時出現復雜條帶，結果難以判斷[4]。微板核酸雜交ELISA 法雖然特異性較高，但雜交后需復雜的顯色步驟，雜交背景也很容易受各種因素的干擾。

本研究采用型特異性引物PCR擴增法進行基因分型，在嚴格的PCR條件下根據產物片斷的大小判斷基因型別方法較為簡便快速，特異型高，檢測費用較低。但由于有些樣本的HBV濃度較低或其他原因使結果呈假陰性而導致無法分型或會出現較復雜的帶型從而不利于結果判斷，尤其當同一標本混有兩種基因型時更無能為力，另外由于HBV基因變異的多樣性，巢氏PCR分型法不能鑒定100%的樣品。今后還需進行更多的臨床研究和實驗。

總之應用型特異性引物PCR方法進行HBV基因型檢測，方便，準確，成本低，可用于大規模的流行病學調查。

[1] 陳鐘先,齊舒,方勇.湖北地區乙型肝炎病毒基因型分布與臨床的相關性[J].中華肝臟病雜志,2006,25(2):214-217.

[2] De Castro L,Araujo NM,Sabino RR,et al.Nosocomial spread of hepatitis B virus in two hemodialysis units,investigated by restriction fragment length polymorphism analysis[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis ,2000,19(7):531-537.

[3] OkamotoH, Tsuda F, TanakaT,et al.Typing hepatitisB virusby ho-mology in nucleotide sequence: comparison of surface subtype[J]. J Gen Virol,1988,69(10):2575-2583.

[4] 楊勝得,何秉賢.乙型肝炎病毒基因型及臨床意義[J].中華傳染病雜志,2001,29(3):187.

R512.6+2

B

1671-8194（2013）01-0077-02