EGFR-TKI在非小細胞肺癌中耐藥機制的研究進展

劉慧慧 王孟昭 胡克 徐燕 馬滿姣 鐘巍 趙靜 李龍蕓 王華竹

1 前言

肺癌中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變主要發生在胞內段編碼結構域（外顯子18-21），包括外顯子19的缺失突變（delE746-A750）和外顯子21點突變（L858R）[1,2]，兩者占所有EGFR激酶突變的90%以上，與對表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）的敏感性有關；此外，還有外顯子18點突變（G719S）以及外顯子20插入突變，前者屬于EGFR-TKI的敏感突變而后者與EGFR-TKI的耐藥有關[3]，發生率均在5%左右。通常情況下，EGFR突變的NSCLC患者對TKI的治療較敏感。EGFR-TKIs通過與ATP或底物競爭性結合胞外的配體結合位點，阻斷EGFR分子內酪氨酸的自身磷酸化及酪氨酸激酶的活化，抑制EGFR同源或與ERBB3異源二聚體的形成，從而抑制EGFR激活，阻止下游信號轉導，抑制細胞周期進程、加速細胞凋亡、抑制血管生成和轉移。但是在臨床工作中，許多患者對EGFR-TKI的治療并不敏感，或者是在治療一段時間后產生耐藥。其耐藥機制主要包括原發性耐藥與獲得性耐藥。本文將總結現有對EGFR-TKI耐藥機制的研究，對其現況及進展進行綜述。

2 原發性耐藥

原發性耐藥是指首次使用EGFR-TKI即產生耐藥，約60% NSCLC患者的耐藥為TKI原發性耐藥。其中，EGFR基因激活突變者有近30%對TKI原發耐藥。

2.1 KRAS突變 KRAS是EGFR下游的一個重要信號傳導通路，這兩者都與肺癌的發生和治療密切相關。突變后的KRAS基因不依賴于上游EGFR的活化而直接激活MAPK信號通路，導致腫瘤增殖、轉移等[4]。大約15%-20%的NSCLC患者中存在KRAS突變。KRAS突變與吸煙有關。Eberhard等[5]的研究中10例非吸煙患者中均未檢測到KRAS突變。同時，有研究[6,7]表明，在肺癌患者中，EGFR基因突變與KRAS基因突變不能共存，有KRAS突變的患者對EGFR-TKI不敏感。一項臨床研究[8]結果指出，KRAS突變患者對TKI的臨床反應率不足3%。這提示KRAS突變可能與EGFR-TKI原發性耐藥有關。Pao等[6]研究的60例肺腺癌患者中，38例對TKI耐藥的患者中有9例存在KRAS突變，但無一例存在EGFR突變，17例EGFR突變患者服用TKI均有效，而9例KRAS突變患者服用TKI均無效。這為KRAS突變與TKI的原發耐藥相關提供了臨床依據。BR21研究[9]中接受厄洛替尼治療的KRAS基因突變患者，與安慰劑組相比，生存期明顯縮短，提示KRAS突變可以導致EGFR-TKI原發耐藥，是其治療的反指征。

2.2 EGFR耐藥突變 NSCLC患者中有大約5%具有外顯子20的插入或復制突變，此突變與外顯子19的缺失突變和外顯子21的L858R突變不同，它對EGFR-TKI的治療不敏感，與EGFR-TKI的原發耐藥有關。此外，有研究[10]發現在某些有較高肺癌發生率的家族中，發生于EGFR激酶結構域的外顯子20的T790M突變，即790位點的蘇氨酸被蛋氨酸取代，也與EGFR-TKI的原發耐藥有關。但這一突變主要在NSCLC患者對TKI的獲得性耐藥中起主導作用（約占50%）。除T790M突變外，EGFR-TKI的原發耐藥也可能與EGFR的其他二次突變有關，例如D761Y突變和E709A突變，它們常與EGFR的藥敏突變同時發生，導致TKI的原發耐藥。體外研究[11]亦證實EGFR雙突變體與單突變體相比，對EGFR-TKI的敏感性要差。

2.3 PI3K/AKT信號通路的激活 EGFR的藥敏突變導致EGFR-TKI耐藥的原因，可能是存在影響下游信號的基因突變。例如，EGFR突變的細胞中PTEN表達下調或缺失時，使得PI3K-AKT過度激活，AKT的過度表達將抵抗凋亡，進而產生對EGFR-TKI的原發性耐藥。有實驗室研究[12]發現，PTEN的表達下調或缺失也與NSCLC的獲得性耐藥有關，但尚沒有臨床證據的支持。同時，研究[13]發現PIK3CA（PI3K的P110α催化亞單位）突變在有EGFR突變的日本肺癌患者中發生率為1.3%，而在沒有EGFR突變的肺癌患者發生率為2.1%。體外研究[14]已經證實，一個組成性活化PI3K的點突變E545K能產生EGFR-TKI耐藥。

2.4 胰島素樣生長因子1受體（insulin like growth factor 1 receptor, IGF1）介導的信號通路 IGF1R信號途徑與EGFR信號途徑的交互作用也是造成EGFR突變細胞耐藥的機制。例如，對于EGFR突變的NSCLC細胞系同時使用厄洛替尼和IGF1R抑制劑時，可以誘導細胞凋亡的發生以及細胞周期停滯，但各自單獨應用時，則只能導致細胞周期停滯，不會誘導細胞凋亡。可能是因為厄洛替尼雖然能持續下調EGFR和ERK磷酸化水平，但由IGF1R介導的AKT活化仍然能起抵抗凋亡的作用。此外，Sharma等[15]研究發現，EGFR突變的NSCLC患者使用EGFR-TKI治療后，體內出現了敏感與耐藥混合的細胞亞群，其中耐藥細胞染色質的特殊狀態是由IGF1R介導的信號途徑和組蛋白脫甲基酶所調節的。同時，有研究[16]指出IGF1R介導的信號通路也是造成EGFR-TKI獲得性耐藥的機制。但是，這一結論僅得到了體外實驗的證實，尚未有臨床證據證明其與獲得性耐藥有關。

2.5 NF-κB信號途徑的激活 Bivona等[17]發現核轉錄因子kappa B（nuclear factor-κB, NF-κB）信號途徑的激活也會引起NSCLC對厄洛替尼的原發耐藥。在具有EGFR突變的肺癌模型中，使用基因學或藥理學方法對NF-κB信號通路進行抑制后可以增加突變腫瘤細胞對厄洛替尼治療的敏感性。同樣，NF-κB抑制因子IκB的低表達是使用厄洛替尼治療無T790M突變的NSCLC患者不良預后的預測指標。這些結論一致表明NF-κB信號途徑的過度激活可能引起EGFR突變的NSCLC患者對EGFR-TKI的原發性耐藥。

2.6 EML4-ALK融合基因突變 研究[18]發現，EML4-ALK融合基因在動物體內外實驗中均有明顯的致瘤活性，在NSCLC的發生發展過程中起著重要作用，EML4-ALK融合基因突變主要發生于年輕、不吸煙的肺腺癌患者中，病理類型一般為腺泡型或實體腺癌伴粘液分泌型，與EGFR、KRAS突變不共存。Shaw等[19]發現在很少或不吸煙且沒有EGFR突變的NSCLC患者中，有33%的患者可檢測出EML4-ALK融合基因；同時，他們還對53例NSCLC患者進行EGFR-TKI藥物治療，其中療效明顯的19例患者均不存在EML4-ALK融合基因，而對EGFR-TKI耐藥的34例患者中有29%可檢測出該融合基因。因此，EML4-ALK融合基因可能是EGFR-TKI原發性耐藥的重要機制。

2.7 BRAF基因突變 BRAF基因是位于EGFR信號通路下游的信號分子，BRAF蛋白介導RAS與MAPK結合，調節腫瘤細胞增殖、分化和凋亡。約2%-3%的NSCLC患者存在BRAF突變，其中最常見的是V600E[20]。有研究[21]表明，BRAF突變主要發生于肺腺癌患者，與KRAS和EGFR基因突變不共存。隱含BRAF基因V600E的NSCLC患者對MEK抑制劑PD0325901敏感，但對EGFR-TKI耐藥。但由于BRAF在NSCLC中突變率較低，尚需大樣本研究證實此突變是否與EGFR-TKI的原發性耐藥有關。

2.8 人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2, HER-2）突變 HER-2蛋白同EGFR一樣，也是表皮生長因子受體HER家族的成員之一，可以與其他HER家族成員形成同源或異源二聚體，并在NSCLC發生發展過程中起重要作用。HER-2基因突變常見于年輕不吸煙的亞裔女性，病理類型多為腺癌，與EGFR及KRAS突變不共存。約2%的NSCLC患者存在HER-2基因突變[22]。此突變使得受體持續激活，從而導致腫瘤細胞不斷增殖、轉移。體外研究[23]已經證實HER-2突變的NSCLC細胞株對EGFR-TKI耐藥。Han等[24]的研究發現4例HER-2突變的NSCLC患者中無一例對吉非替尼有反應，從而為HER-2基因突變可能導致EGFR-TKI原發耐藥提供了臨床依據。

2.9 c-Met/肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）信號通路 c-Met基因擴增和過度表達參與了NSCLC對EGFR-TKI的原發性和獲得性耐藥這兩種機制。對于有EGFR激活突變的NSCLC腺癌細胞系，c-Met基因擴增和過度表達可使得自分泌信號通過c-Met/HGF袢傳導，導致PI3K/AKT信號途徑傳導恢復，而不依賴于EGFR或ERBB3的激活，從而產生對EGFR-TKI的原發性耐藥[25]。同時，c-Met基因擴增也是20%NSCLC患者獲得性耐藥的重要機制[26]。肝細胞生長因子受體（hepatocyte growth factor,HGF）表達增加也會過度激活MET介導的PI3K/AKT通路，降低EGFR-TKI對這種信號級聯反應的抑制。與獲得性耐藥作用機制不同，原發性耐藥主要是通過GRB2相關結合蛋白1增加MET的HGF活化，而不是ERBB3的作用[27]。

2.10 成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF）-成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor,FGFR）信號途徑 特異性的FGF及FGFR是NSCLC腫瘤細胞自分泌信號通路的重要組成部分。Marek[28]和Kuhn[29]等發現反義RNA、RNA干擾技術、中和FGF2抗體以及FGFRTKI等可以抑制NSCLC細胞系的增殖及腫瘤生長。說明FGF和FGFR的共表達為某些NSCLC細胞系提供了自分泌生長信號通路。此通路也被證實可以介導EGFR-TKI耐藥。FGF-FGFR信號通路主要存在于肺鱗癌和大細胞癌中，使腫瘤細胞更傾向于向間充質狀態分化[28,30]。這與對EGFRTKI敏感的肺腺癌及支氣管肺泡癌原發腫瘤或細胞系的分化狀態的多樣化明顯不同。Thomson等[30]還發現細胞內信號轉導向FGFR及血小板源性生長因子受體（platelet drived growth factor receptor, PDGFR）介導的信號通路的轉變與上皮細胞-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的發生同步。而EMT現象已被研究證實與EGFRTKI耐藥相關[31]。

2.11 EMT現象 EMT參與了胚胎發育過程中的器官塑性，是一種重要的自然生理現象。研究[32]發現，很多上皮來源的腫瘤都存在EMT，如肺癌、乳腺癌等。上皮細胞在失去上皮特征而重獲間質特征以后，在侵襲、抗凋亡及轉移能力方面都有很大提高。轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGFβ1）、FGF、HGF、PDGF等均可能是EMT的誘導因子。同時，參與誘導EMT的信號通路（如Src、MAPK及PI3K等）均在EGFR-TKI耐藥中發揮作用。研究認為，EGFR-TKI的原發性耐藥株通常表現為上皮基因表達下調，出現間質細胞表型，即EMT現象。Coldren等[31]也通過研究證實EMT是NSCLC對EGFR-TKI原發耐藥的機制之一。同時，EMT也已在實驗室細胞模型中被證實與EGFR-TKI獲得性耐藥相關[33,34]。最近，有研究[35]發現EMT確實存在于獲得性耐藥的EGFR突變的NSCLC患者中。但耐藥腫瘤組織中的間質樣細胞是在TKI治療前即存在，還是在TKI治療過程中誘導發生尚不明確。

3 獲得性耐藥

雖然在EGFR突變的NSCLC患者中吉非替尼和厄洛替尼可以起到很好的療效，但大部分患者在治療6個月-12個月內會發生獲得性耐藥。目前對EGFR-TKI獲得性耐藥機制的認識主要有以下幾個方面。

3.1 EGFR二次點突變 EGFR的二次點突變可能是在EGFRTKI治療過程中產生的，但也有大量證據支持此突變是在開始TKI治療前即存在，只是通過吉非替尼或厄洛替尼的作用被篩選出了耐藥克隆。T790M突變是NSCLC患者中最常見的EGFR-TKI獲得性耐藥機制，其突變位點在20外顯子，即酪氨酸激酶活化域的790位蘇氨酸殘基被蛋氨酸取代。TKI獲得性耐藥的EGFR突變患者中有50%存在T790M突變[36,37]。其導致耐藥的可能機制：①790位點的蘇氨酸（T）被一個較大體積的蛋氨酸（M）替代，出現位阻效應，減弱了EGFR與ATP口袋中藥物的結合力。蛋氨酸的一條較大的氨基酸側鏈構成的空間位阻，阻止了TKI和EGFR酪氨酸激酶催化域中的Mg-ATP位點的結合，但對ATP和酪氨酸激酶的結合沒有影響，激酶可以繼續磷酸化。②T790M突變使EGFR與ATP的親和力增加了至少10倍，恢復到野生型EGFR水平，ATP可以完全取代EGFRTKI與EGFR結合。近年來又發現了3個與獲得性耐藥有關的EGFR第二位點突變，包括D761Y（外顯子19）、T854A（外顯子21激活環）[38]和L747S（外顯子19）[39]。這些突變的發生率較低，三者發生率總和不到5%。其中，D761位于α-C的螺旋段，突變成酪氨酸后可能會影響鹽橋的形成，且干擾受體的催化區；T854是與藥物接觸的氨基酸，突變成更小的丙氨酸可能會增加特異性口袋的尺寸，減弱甚至抵消與EGFR-TKI的結合力；L747位于β3鏈和α-C螺旋結構之間環區起始段，是調控受體活性構象平衡的重要氨基酸。

3.2 MET基因擴增 MET是HGF的受體，編碼HGF酪氨酸激酶受體的跨膜區，與腫瘤的侵襲、轉移和擴增有關。2007年，Engelman等[40]首次提出原癌基因MET的擴増是EGFR-TKI的一種耐藥機制；他們在構造吉非替尼耐藥細胞株模型時發現這種耐藥是由MET基因擴增引起的；有22%的EGFR-TKI耐藥患者的腫瘤組織中存在MET基因擴增。MET原癌基因擴增存在于20%的TKI獲得性耐藥的NSCLC患者中，其中有近一半的患者同時具有T790M突變。MET擴增通過激活ERBB3-PI3K信號途徑來持續激活下游的信號通路，從而避開EGFR-TKI的靶點-EGFR，導致NSCLC對TKI產生耐藥。MET的配體HGF除了可以導致原發性耐藥以外，也能引起TKI的獲得性耐藥。Turke等[27]通過檢測并對比27例用藥前后的NSCLC患者的腫瘤組織，發現有16例患者在經過TKI治療后HGF增多。Guix等[41]研究發現HGF通過選擇性擴增MET基因過表達的克隆而發揮對EGFR-TKI的耐藥作用。

3.3 EGFR突變基因丟失或拷貝數下降 Tabara等[42]研究發現EGFR突變基因丟失或拷貝數下降可能會引起EGFR-TKI的獲得性耐藥。在建立的厄洛替尼耐藥細胞系中，EGFR激活突變（外顯子19 delE746-A750或外顯子21 L858R）的基因拷貝完全或部分丟失。而野生型EGFR基因拷貝數沒有變化。因此，推測EGFR突變基因丟失或拷貝數下降可能會導致TKI的獲得性耐藥。

3.4 NSCLC向小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）的組織學轉變equist等[35]研究報道，在37例EGFR-TKI耐藥的NSCLC腫瘤組織中有5例出現了向SCLC組織學類型的轉變，促使這一轉變的分子學改變尚不清楚，但此組織學轉變在79例未經EGFR-TKI治療的NSCLC患者的腫瘤組織中未發現。

3.5 其他機制 EGFR T790M突變和MET基因擴增是NSCLC患者EGFR-TKI獲得性耐藥的主要機制，占60%左右。而其他40%獲得性耐藥的原因還在積極探索中。如前所述，PTEN表達下調或缺失、IGF1R介導的信號通路及EMT等可能參與了EGFR-TKI原發性和獲得性耐藥兩種機制。其他可能導致獲得性耐藥的機制尚有：①研究[43]報道mTOR與EGFR-TKI獲得性耐藥有關，mTOR通路被阻斷后，腫瘤生長會受到干擾，可能是因為EGFR-TKI對核糖體p70S6激酶的活化不起作用；②ATP結合盒式轉運蛋白（ATP binding cassette, ABC）的藥泵激活后可將藥物泵到細胞外。ABCG2蛋白突變后可以把TKI泵到細胞膜外，從而降低腫瘤細胞內TKI的藥物濃度，產生耐藥[44]。

4 結語

EGFR-TKI靶向治療相對于傳統化療具有更大的優勢，已成為晚期NSCLC的有效治療手段。從基因學角度尋找適合靶向治療的患者，能達到更好的治療效果。然而，原發和獲得性耐藥現象不可避免地發生使靶向治療的應用產生了瓶頸，增加了臨床上治療肺癌的難度。但是研究者們對EGFR-TKI耐藥機制的不斷探索，能夠幫助我們找到新的可以預測藥物療效并指導治療方案的分子學標志物，從而使靶向藥物的治療效果進一步提高，并能更好地選擇EGFR-TKI的治療對象。同時，我們還可以嘗試克服EGFR-TKI耐藥的發生，從而給耐藥患者帶來重獲治療的希望。