口蹄疫懸浮滅活疫苗質量控制措施

武春芳，韓四娥

(金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特010030)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄獸動物的嚴重急性傳染病，由于其傳播快，給畜牧業造成了巨大的經濟損失，而且嚴重影響國際貿易。世界動物衛生組織將其列為必須上報的疫病之一，我國農業部將其列為一類動物疫病。FMDV包括O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和 SAT3 共 7 個血清型，血清型間無交叉保護，造成疫病控制難度較大。口蹄疫的防控是一個系統工程，高效、安全的疫苗是防止口蹄疫疫情發生的最有效方法之一。我國多年來一直采取轉瓶培養方式生產口蹄疫，該生產方式存在污染率高、收獲率低等問題，對疫苗質量的控制存在一定的困難。從2009年開始，國內部分口蹄疫疫苗生產企業采用生物反應器技術進行細胞培養、病毒增殖等以來，口蹄疫疫苗質量標準(如效力評價指標)有了較大的提高，基本與世界動物衛生組織(OIE)推薦標準接軌。在此基礎上，為進一步提高疫苗質量，保證免疫效果，農業部規定自2013年9月1日起，國家強制免疫用口蹄疫疫苗將逐步執行新的疫苗質量標準。

1 質量控制的意義

1.1 國家強制要求 隨著國家對口蹄疫防控的重視和疫苗生產時間的延長，口蹄疫疫苗的監管制度日趨完善，管理體系已基本形成。研制環節有《新獸藥研制管理辦法》，注冊環節有《獸藥注冊辦法》;生產環節有《獸藥生產質量管理規范》、《獸藥產品批準文號管理辦法》、《獸藥標簽和說明書管理辦法》，并發布了口蹄疫疫苗相關質量標準;流通環節有《獸藥經營質量管理規范》、《獸用生物制品經營管理辦法》;監督環節有《獸藥質量監督抽樣規定》。為進一步確保疫苗質量，農業部還采取駐廠監督、飛行檢查、批簽發等多種日常監管方式。

1.2 企業自身要求 產品質量是企業永恒的主題，是企業一切工作的基礎，是鞏固和擴大市場份額的一大優勢和重要法寶，是關系到企業生存和發展的頭等大事。企業在追求利潤最大化時，也要勇于承擔社會責任，因為它可以塑造企業形象，打造企業品牌價值，從而獲得長遠效益。諸多事件證明忽略社會責任對企業效益的損失是無法估量的。

1.3 生物制品特殊性 由于口蹄疫疫苗本身的特性和安全防護方面的漏洞，在某些生物安全問題方面，也會出現造成不應有的損失。概括起來主要有可能對研發、生產、質檢和質量監督等人員造成感染、對環境造成污染?？梢哉f口蹄疫從研制開發到產品的應用，甚至可以延伸到應用之后的一定時期，都存在著生物安全方面的因素與風險。口蹄疫的生物安全問題直接或間接影響人類的生命健康安全，關注與重視口蹄疫的生物安全問題，不僅是提高和保障動物的健康問題，更重要的是提高與保障全人類的生命健康、促進社會的穩定問題。

2 質量控制措施

2.1 獸藥GMP 我國農業部于1989年開始實施獸藥GMP，規定自2005年12月31日起，未取得《GMP合格證》的企業不得進行藥品生產，自2012年2月1日起，各省級獸醫行政部門不再受理轉瓶培養生產方式的獸用細胞苗生產線項目獸藥GMP驗收申請，全面GMP認證及管理升級使生產企業的工藝設備和條件有了極大地改善。

2.2 過程控制

2.2.1 原輔料的質量控制 口蹄疫疫苗生產重要原輔料有培養基、206佐劑、血清等。由于口蹄疫疫苗配制成分中有很多生物源性材料，例血清、動物源性水解乳蛋白等，所以必須要求這些產品的供貨商提供外源病毒的檢驗報告。歐盟的1999/104/EC官方指令明確要求檢測這些原料產品中是否含有牛海綿狀腦病病毒[1]。生物制品在接種后引起的不良反應中，有相當比例是由于生產過程中使用的原輔材料所致。根據原輔料的使用情況增加相應的檢測項目，如微生物限度、熱原檢查、細菌內毒素檢查等生物安全性質控項目，以進一步確保使用的安全性。因此，在疫苗制備中原輔料成分不再被看作是無活性的物質[2]，生物制品生產用原輔料的理化性質和安全性對生物制品的有效性和安全性有著直接的影響。《中國獸藥典》二O一O年版三部新增血清及活疫苗外源病毒檢驗項目，并通過組織培訓、專項檢查、座談等多種形式進一步落實該項工作，足見其重要性。

2.2.2 細胞與病毒培養工藝的質量控制 相對轉瓶培養時代，口蹄疫懸浮培養在對傳統工藝的革新與發展，主要的三個關鍵控制點，其一是對培養基的優化，細胞由貼壁生長方式轉變為懸浮生產方式，這就需要選擇個性化的培養基，滿足其生產要求，并不斷對原有細胞株進行適應性培養馴化后，進行逐級放大培養;其二是懸浮培養過程的優化，如培養的轉速、溫度、溶解氧濃度(DO)、pH值、細胞接種密度、細胞活力(大于等于95%)等指標，通過細胞倍增時間和細胞計數來評估細胞培養質量，控制接毒時間(達到2×106個/mL);其三是反應器的優化，目前生物反應器能夠進行實時監測和控制的參數有溫度、攪拌轉速、DO和pH值等物理環境參數，而如在線滅菌系統(SIP)自動滅菌與定位清洗(CIP)清洗的全自動生物反應器、生物反應器的自動取樣與分析系統等，一些重要器件如耐高溫滅菌的隔膜閥的抗疲勞、抗膨脹性以及器件加工工藝與標準都需進一步優化;供氧方式、攪拌方式、熱傳遞也需進一步探索。

2.2.3 純化濃縮工藝的質量控制 口蹄疫滅活疫苗誘發有效的免疫應答，通常需要較大量的抗原，而疫苗中的非病毒蛋白可引起免疫副反應，另外，伴隨病毒增殖而產生的病毒非結構蛋白對于感染動物的甄別亦帶來困難。因此，在滅活疫苗特別是多價苗生產中，為了保證免疫效果，降低疫苗使用劑量，減少接種引起的有害反應，利于病毒抗原和成品苗的貯存，便于免疫和感染的鑒別，就必須對病毒抗原進行濃縮純化。現在常用于大規模生產的純化濃縮方法是超濾和沉淀法，聚乙二醇6000(PEG 6M)或聚環氧乙烷(PEO)不僅可以達到理想的濃縮倍數，還可大大降低抗原收獲物中非病毒蛋白成分及含量。目前，在生產中用切向流超濾裝置或中空纖維過濾系統或震動篩進行濃縮[3]。然而，過濾材料的載流量小于等于100 ku時純化效果不好，而大于200 ku時146S的損失又大[4]。使用PEG純化時，能夠充分的去除來源于BHK21疫苗中引起過敏反應的物質。沉淀的抗原用低速離心法獲得，也可用助濾劑進行沉淀抗原的過濾，如鈣化的硅藻土，比離心法方便的多[5]。滅活抗原也能用PEO沉淀法有效地沉淀。PEG沉淀可充分除去變應原成分，PEO可使FMDV濃縮達1000倍，從病毒收獲物中最少除去95%的雜蛋白質[6]。我國口蹄疫生產企業對滅活抗原進行一系列澄清、濃縮與純化工藝處理，有效去除了各類非抗原蛋白和其他雜質，確保了疫苗的效力和高安全性。

2.2.4 檢驗過程的質量控制 口蹄疫的各項技術檢測指標在嚴格執行《規程》的情況下，重點進行了幾項檢驗。采用蔗糖密度梯度法對FMDV抗原進行146S測定，實現了定量添加抗原，改變疫苗質量控制以“定性而非定量”的方式，確保了疫苗效力;采用凱氏定氮法對疫苗中雜蛋白含量進行定量檢測，實現了對疫苗有效成份的客觀評價;口蹄疫外殼蛋白大約為29 kD，按變性聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)條帶方法實現了對疫苗有效抗原和雜蛋白含量進行簡便的評價;按照《中華人民共和國獸藥典》二部細菌內毒素檢查法對整個工藝進行內毒素的控制。

2.2.5 生產過程的質量監督 質量活動必須貫穿于整個生產過程，以得到符合既定質量標準的產品?？谔阋咭呙缟a從原料的進廠到生產后檢驗合格放行，涉及到許多工序和環節，在每個環節都必須把好質量關，才能最終保證產品質量，任何一個環節的疏忽，都有可能導致產品質量的不合格。因此，口蹄疫疫苗生產企業應當根據自身產品的特點制訂合理的產品工藝，并結合設備特點制訂相應的崗位標準操作規程，明確生產流程和重點工序質量監控點，分工明確，要通過對生產過程的監督和控制來保證產品的質量。通過全員參與和有效的預防來減少生產過程中差錯和污染，從而減少質量事故的發生。

3 展望

2013年6月13日農業部發布《關于做好口蹄疫疫苗質量標準提升工作的通知》，明確指出，在現有口蹄疫疫苗質量標準的基礎上，提高效力檢驗標準，增加內毒素和總蛋白檢測參數:2013年9月1日起，新生產的口蹄疫滅活疫苗及合成肽疫苗效力檢驗標準由每頭份3 PD50提高到6 PD50，新生產的口蹄疫滅活疫苗內毒素每頭份疫苗不超過50 EU;口蹄疫滅活疫苗總蛋白檢測參數分兩個階段實施，自2014年1月1日起，對總蛋白含量實施不定期抽樣檢測，并公開檢測結果，2015年1月1日起，總蛋白含量每毫升疫苗不高于500 ug。農業部在提高口蹄疫疫苗抗原含量和內毒素檢測標準的基礎上，2015年開始將進一步提高雜蛋白檢測標準。目前我國獸用疫苗中強制免疫苗品種較少但所占比重較大，而畜牧養殖規?；?、現代化將推動整個行業需求結構調整，向品質化、多樣化方向發展。隨著上游畜禽養殖規模的穩定增長，必須免疫的強制免疫苗的需求將穩中有升，同時相關產品的毒株改良、佐劑改良、工藝改進(如懸浮技術的普遍使用)、質量提升將是大勢所趨。由于我國強制免疫疫苗生產廠家數量較多，其在生產設備、技術力量、工藝水平等方面差別較大，國家采購標準的提高將加速行業優勝劣汰，有利于優勢企業市場集中度的提升。預計除口蹄疫疫苗外，未來高致病性禽流感、豬藍耳疫苗等其他強免疫苗的政府采購標準都有望進一步提高。

[1]張懷宇，王泰健，趙啟祖.口蹄疫滅活疫苗質量控制和檢測技術的研究進展[J].獸醫導刊，2007，3:25-27.

[2]陳瑞愛，裝仇福，何 芳.高致病性藍耳病滅活疫苗的質量控制[C]//獸醫生物制品學 獸醫微生物學學術論壇論文集:湖北，2008:405-407.

[3]盧永干.我國口蹄疫滅活疫苗生產工藝的技術進步[C]//第11次全國口蹄疫學術研討會論文集:遼寧大連，2007:948-950.

[4]Barteling S J.Development and performance of inactivated vaccines against foot and mouth disease[J].Rev Sci Tech，2002，21(3):577-588.

[5]Barteling S J.Foot and mouth disease vaccine production and research in the Netherlands[J].Vet Q，1987，9:5-15.

[6]張淑剛，張永光.口蹄疫滅活疫苗研究進展[J].動物醫學進展，2008，29(12):43-47.