BHK21懸浮細胞在2～8℃下短期保存的研究

賈 英，趙麗霞，馮俊林，李超華，韓四娥

(內蒙古金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特010030)

細胞的最適溫度范圍很小，如哺乳動物細胞的最適溫度為37℃。絕大部分細胞的最適生長溫度是(37±0.5)℃，而細胞存活的溫度范圍相對來說大了很多。細胞對低溫的耐受力比對高溫的耐受力強，降低溫度它們仍能生長，但速度變慢，如細胞在-196℃能保存數年甚至更長時間[1]。在生產中，有時會由于不可控因素導致緊急停產和培養細胞的短時間保存，然后需要快速復活。與種細胞常規復活方法相比，冷藏保存BHK21細胞懸液能快速滿足大生產的種細胞需求，大大縮短了生產啟動周期，適合動物細胞大規模培養[2]。生產中為了使細胞的生長狀態更好且能夠穩定傳代，同時避免污染或發生細胞變異，需要不斷地更換新種子，因此就需要一種快速有效的復活手段更換現有細胞，存放懸液無疑是一種既快又方便的方法[3]。

1 材料與方法

1.1 主要材料 BHK21懸浮細胞(金宇保靈生物藥品有限公司)，5 L反應器(上海傲中)，倒置顯微鏡(XDS-1B)，血球計數板(XB-K-25QIUJING)，2～8℃冰箱(中國海爾)，取樣瓶(SCHOTT 250 mL)。

1.2 實驗方法 用5 L反應器接種BHK21懸浮細胞，在溫度為37℃、pH為7.1、溶解氧為60%的條件下進行培養。培養到細胞密度5×106cells/mL左右時，無菌分取5個樣品于滅菌的50 mL取樣瓶中，每瓶30 mL，第一瓶為細胞原樣(記為0 h)，檢測細胞密度和細胞活力，其余樣品置于2～8℃冰箱中短期靜置保存。在24、48、72、96 h分別取一個樣品，檢測細胞密度和細胞活力。本實驗用同樣的方法重復10次。檢測數據分別繪制曲線圖并進行統計學分析，得出結論。

2 結果與分析

用1.2項的方法進行了10次實驗，分別對每次實驗樣品的細胞密度和細胞活力進行檢測，檢測結果如表1所示。

表1 實驗樣品的細胞密度和細胞活力檢測結果

2.1 繪制曲線圖 分別繪制細胞密度與細胞活力曲線圖(圖1、圖2)，曲線圖顯示每個批次的不同時間段樣品的檢測值變化不大，細胞密度與細胞活力沒有隨保存時長發生大的變化，趨勢線似為平行直線，初步判斷在整個培養過程中，細胞密度和細胞活力分別與保存時長呈線性相關。但曲線圖并不能說明細胞密度與保存時長或細胞活力與保存時長的線性相關的緊密程度，故采用統計學法進一步論證其線性關系。

圖1 細胞密度與保存時長曲線圖

2.2 統計學分析 現利用統計學中的線性相關系數法及其公式:和直線回歸方程斜率公式:分別以細胞活力和細胞密度為自變量，相應保存時長為依變量求出樣本的線性相關系數r和直線斜率b，具體數值見表2、表3數據。在統計學中相關性質判定時，相關系數r值正時為正相關，r值負時為負相關。而且，按r的絕對值大小，定0～0.33為弱相關，0.33～0.66為中等相關，0.66～1為強相關。

圖2 細胞活力與保存時長曲線圖

表2 細胞活力對保存時長的相關系數與直線斜率數據表

表3 細胞密度對保存時長的相關系數與直線斜率數據表

表2、表3中的樣品r值代表了細胞活力(細胞密度)與細胞保存時間這兩個變量的相關緊密程度，數據表明這兩個變量的相關程度在中等相關以上。而表2、表3中的樣品b值是代表兩個變量呈線性相關時回歸直線的斜率，且樣品b值的絕對值全部小于0.1，說明細胞活力(細胞密度)與細胞保存時間這兩個變量的回歸直線基本為水平直線。

3 討論與結論

首先對細胞活力的10個實驗樣本進行直線相關性求解，求得相關系數中除了S101和S106兩個樣本為弱相關，其余八個樣本為線性強相關，也就是說80%的樣本為線性強相關，說明細胞在2～8℃條件下保存時，細胞活力與保存時長呈線性規律。從直線斜率上分析，10個樣本的直線斜率絕對值全部小于0.06，基本可視為水平直線，說明樣品中細胞活力沒有隨保存時長的增加而發生變化。

其次對細胞密度的10個實驗樣本進行直線相關性求解，求得相關系數中60%為線性中等相關，40%為線性弱相關，但在60%為線性中等相關的樣品中，直線斜率絕對值全部小于0.001，可視為水平直線。又因為在細胞計數中存在點樣、計數、稀釋等誤差，很小的數值誤差就會形成大的統計學偏差，所以對細胞密度來說，也可認為在平溫保存過程中沒有發生降低現象。在生產和實驗過程中，一般懸浮細胞的生產周期為48～72 h，而病毒繁殖周期也在10～24 h左右，所以此次研究偏重于生產，只在96 h時間段內進行了試驗。

在實驗和生產中，細胞的保存與培養起著同等重要的作用。細胞在中長期保存普遍采用-79℃超低溫冰柜或-196℃液氮保存。但BHK21懸浮細胞在96 h內短期保存時，經過試驗證實，在2～8℃條件下細胞活力和密度不受影響，細胞不會隨培養時長的增加而出現活力降低或死亡現象。因此，如果短時間內對BHK21懸浮細胞進行保存時，無論是實驗還是生產，無論是便于操作還是利于細胞生存，2～8℃是一個最適的保存溫度。

[1]張元興，易小萍，張 立，等.動物細胞培養工程[M].北京:化學工業出版社，2006:224-225.

[2]范田梅，井蓮娜，趙海源，等.冷藏保存BHK21細胞懸液及復蘇試驗[J].中國獸藥雜志，2010，44(3):41-44.

[3]羅燕雯，王玉智，陳興芳，等.不同溫度保存BHK21細胞和IBRS2細胞試驗[J].中國獸醫雜志，2003，37(12):57-58.